О взаимосвязи интенсивности образования оксида азота и S-нитрозотиолов в период ранней постнатальной адаптации телят

За последние десятилетия в большей или меньшей степени были исследованы функции оксида азота (NO " ), оценена роль этого соединения в работе различных систем органов и тканей, выявлены ферменты, отвечающие за его синтез. В настоящее время NO " рассматривается как универсальный нейротрансмиттер, регулятор функций сердечно-сосудистой, пищеварительной, респираторной, мочеполовой, иммунной, репродуктивной систем животных. Постулируется также наличие у оксида азота антиоксидантных свойств, которые проявляются главным образом благодаря способности действовать как донор электронов в восстановительных реакциях (1). Показано, что NO ^• принимает участие в патогенезе многих заболеваний (2).

Период полураспада оксида азота in vivo составляет несколько миллисекунд, он диффундирует в биологических системах со скоростью 50 мкм/с, то есть может оказывать действие в пределах нескольких микронов от места образования (3). Однако участие NO " в процессах нейротрансмиссии, регуляции тонуса сосудов, воспалительных реакциях требует достаточно продолжительного воздействия.

Предполагается, что NO" оказывает опосредованное действие, через те или иные соединения, выступающие в качестве переносчиков и депо. В различных биологических системах был идентифицирован пул производных NO"  — S- нитрозотиолы (RSNO) со структурой R-S-N=O, в которых NO" ковалентно связан с SH-группами белков и низкомолекулярными тиолами, например глутатионом или цистеином (4). В настоящее время считается, что стабилизация NO" в форме RSNO может предотвращать его локальную инактивацию гемоглобином, молекулярным кислородом или супероксидом, что позволяет переносить биологические эффекты оксида азота на мишени, отдаленные от места его образования (5, 6). Косвенно это подтверждается очень сходным действием NO" и RSNO in vivo и in vitro. В частности, показано, что RSNO могут вызывать расширение сосудов с последующим снижением давления крови и антитромбозный эффект посредством ингибирования агрегации тромбоцитов. Вероятно, эндогенные RSNO могут регулировать потоки NO", в частности, в сосудистой системе (7).

Однако в вышеперечисленных аспектах биологической роли оксида азота еще остается достаточное количество темных пятен, и проблемы резервирования, переноса, форм депонирования NO " в настоящее время являются весьма спорными и не до конца исследованными, в частности значение этих процессов при постнатальной адаптации животных.

Целью нашей работы была оценка взаимосвязи между интенсивностью образования NO " и RSNO в период ранней постнатальной адаптации телят.

Методика. Объектом исследования служили клинически здоровые телята симментальской породы в возрасте от 0,5-1,5 ч после рождения до 32 сут ( n = 15) и коровы-матери ( n = 15). Кровь у животных отбирали из яремной вены с использованием в качестве антикоагулянта ЭДТА-Na (5-6 мг/мл крови). Анализировали только образцы негемолизированной плазмы. Образцы амниотической жидкости у коров получали в период родов. При необходимости плазму и амниотическую жидкость до исследования хранили при –20 ^оС.

Концентрацию стабильных метаболитов NO * в плазме крови и амниотической жидкости оценивали как сумму ионов NO ^- и NO ^- модифицированным нами спектрофотометрическим методом на основе восстановления нитрата до нитрита хлоридом ванадия с последующим определением образовавшегося NO ^- с помощью реактива Грисса (8).

Концентрацию RSNO в плазме крови определяли с использованием HgCl 2 , которая катализирует высвобождение NO * (9).

Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием t -критерия Стьюдента.

Результаты. Наиболее высокая концентрация стабильных метаболитов NO * в плазме крови отмечена в первые часы жизни телят; с возрастом она снижалась (табл. 1). Это подтверждается данными, полученными ранее как нами, так и другими авторами (10, 11).

1. Концентрация стабильных метаболитов оксида азота (NO * ) и S-нитрозотиолов (RSNO) в плазме крови клинически здоровых телят симментальской породы разного возраста

Возраст телят, сут	|       NO * , мкмоль/л       |	RSNO, нмоль/л
0,5-1,5 ч	909,9 ± 66,8*	509 ± 20,6*
1	649,7 ± 81,7*	2122 ± 214,3*
2	393,8 ± 47,8*	2108 ± 154,2*
3	410,6 ± 37,5*	2670 ± 98,6*
4	376,2 ± 27,5*	3215 ± 301,9
10-15	223,6 ± 13,9*	3046 ± 284,4
26-32	78,9 ± 9,8	3397 ± 56,3
* P < 0,05-0,001 (по сравнению с	животными в возрасте 1 мес).

Тот факт, что такая высокая интенсивность образования NO * характерна для телят в период внутриутробного развития, подтверждается тем, что в амниотической жидкости у коров-матерей концентрация стабильных метаболитов этого соединения была достаточно высокой и по абсолютному значению приближалась к таковой в плазме крови новорожденных животных. Этот показатель также существенно превышал концентрацию метаболитов NO * в плазме крови коров как до, так и в период родов (табл. 2).

Через 1 сут после рождения концентрация NO * в плазме крови телят снижалась и через 2-3 сут была примерно в 2,5 раза ниже, чем через 0,5-1,5 ч после рождения (до получения первой порции молозива).

В первые часы жизни телят концентрация NO * была необычайно высокой, а RSNO — низкой. К возрасту 1 сут концентрация RSNO резко возрастала и была в 4,2 раза выше, чем через 0,5-1,5 ч после рождения. Начиная с 1-суточного возраста, концентрация RSNO увеличивалась постепенно и к 4-суточному возрасту была в 6,3 раза выше, чем в первые 0,5-1,5 ч жизни, а затем стабилизировалась. В то же время концентрация стабильных метаболитов NO * в плазме крови в этот период снижалась примерно в 2,4 раза по сравнению с первыми часами жизни. К 1-месячному возрасту концентрация NO * и RSNO достигала значений, близких к таковым у взрослых животных.

2. Концентрация стабильных метаболитов оксида азота (NO * ) и S-нитрозотиолов (RSNO) в плазме крови и амниотической жидкости коров до и в период родов

Время отбора пробы	Плазма крови		Амниотическая жидкость
	NO * , мкмоль/л	RSNO, нмоль/л	NO * , мкмоль/л	RSNO, нмоль/л
За 7-10 сут до родов	42,5 ± 6,84	4450,0 ± 439,7	–	–
В период родов	179,9 ± 6,85*	4116,4 ± 215,0	812,5 ± 46,97*	563,4 ± 100,4*
* P < 0,05-0,001.

При сравнении возрастной динамики концентрации в плазме крови телят

NO * и RSNO обнаружена отрицательная корреляция ( r = -0,918; P = 0,003), что мо-32

жет свидетельствовать о формировании депо NO " в период постнатальной адаптации в форме RSNO.

По всей вероятности, повышенная концентрация NO " служит одним из факторов адаптации сердечно-сосудистой системы (в частности малого круга кровообращения новорожденного) к внеутробному существованию, увеличения резервов вазоделятации и поддержания сократительной функции сердца, что весьма важно в первые часы жизни для регуляции артериального давления при позе стояния, которую теленок может принимать уже через 15-20 мин после рождения.

Кроме того, активация образования NO " является одним из механизмов адаптации сердечно-сосудистой и центральной нервной систем в условиях гипоксии, развивающейся в первые сутки постнатального периода развития (12, 13). Этот механизм позволяет сохранять адекватное кровоснабжение тканей, оптимизировать снабжение последних кислородом и предотвращать вазоспастические явления в первые сутки жизни.

Рассматривая RSNO в качестве резерва NO " можно предположить, что они вовлечены в интенсивный цикл генерации—декомпозиции и не накапливаются в первые часы жизни. Это, вероятно, связано с необходимостью использовать практически весь образуемый и депонированный NO ^" для оптимизации процессов адаптации новорожденных и особенно сердечно-сосудистой системы к новым условиям окружающей среды и, возможно, к режиму дыхания.

Достаточно резкое увеличение концентрации RSNO в плазме крови к концу 1 сут жизни может быть связано с интенсификацией процессов депонирования NO " , что, вероятно, служит защитным механизмом, нейтрализующим возможный токсический эффект повышенной концентрации NO " , связанный с образованием высокореактивного пероксинитрита в результате взаимодействия этих соединений, сопровождающийся повреждением митохондрий, ДНК, интенсивным апоптозом (2).

Таким образом, при адаптации новорожденных телят к новым условиям существования происходит интенсивное взаимодействие между системами генерации и депонирования оксида азота, что обеспечивает поддержание оптимальной концентрации этого соединения в организме животных. S-нитрозотиолы служат одной из форм стабилизации концентрации оксида азота, предотвращая его инактивацию. В то же время S-нитрозотиолы можно рассматривать как своеобразный «буфер» для избыточного количества оксида азота, которое может оказывать токсическое воздействие в результате образования пероксинитрита. При действии экзогенных или эндогенных факторов взаимодействие систем генерации и депонирования оксида азота обусловливает быструю генерацию последнего, что повышает эффективность защитных реакций организма и, в частности, адаптации новорожденных животных к новым условиям существования.

Л И Т Е Р А Т У Р А

• 1.    W i n k D.A., M i r a n d a K.M., E s p e y M.G. e.a. Mechanisms of the antioxidant effects of nitric oxide. Antioxid. Redox. Signal., 2001, 3(2): 203-213.

• 2.    С о с у н о в А.А. Оксид азота как межклеточный посредник. Соросовский образовательный журнал, 2000, 6(12): 27-34.

• 3.    G a l l y J.A., M o n t a g u e P.R., R e e k e G.N. e.a. The NO hypothesis: possible effects of a short-lived, rapidly diffusible signal in the development and function of the nervous system. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87: 3547-3551.

• 4.    H o g g N. The biochemistry and physiology of S-nitrosothiols. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., 2002, 42: 585-600.

• 5.    S t a m l e r J.S., J a r a k i J., O s b o r n e D.I. e.a. Nitric oxide circulates in mammalian plasma primarily as an S-nitroso adduct of serum albumin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89: 7674-7677.

• 6.    R a s s a f T., K l e i n b o n g a r d P., P r e i k M. e.a. Plasma nitrosothiols contribute to the systemic vasodilator effects of intravenously applied NO. Circ. Res., 2002, 91: 470-477.

• 7.    G i u s t a r i n i D., M i l z a n i A., C o l o m b o R. e.a. Nitric oxide and S-nitrosothiols in human blood. Clin. Chim. Acta, 2003, 330: 85-98.

• 8.    Б л и з н е ц о в а Г.Н., Е р м а к о в а Н.В., М у х а м м е д З.Д. и др. Спектрофотометрический метод определения метаболитов оксида азота. Вест. ВГУ. Проблемы химии и биологии, 2002, 1: 5660.

• 9.    K u b e s P., P a y n e D., G r i s h a m M.B. e.a. Inhaled NO impacts vascular but not extravascular compartments in postischemic peripheral organs. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol., 1999, 277(2): H676-H682.

• 10.    Р е ц к и й М.И., Ш а х о в А.Г., Б л и з н е ц о в а Г.Н. и др. Возрастная динамика образования оксида азота в организме крупного рогатого скота. Докл. РАСХН, 2004, 4: 58-60.

• 11.    B l u m J.W., M o r e l C., H a m m o n H.M. e.a. High constitutional nitrate status in young cattle. Comp. Biochem. Physiol. a Mol. Integr. Physiol., 2001, 130(2): 271-282.

• 12.  C o u m a n s A.B., G a r n i e r Y., S u p c u n S. e.a. The role of nitric oxide on fetal cardiovascular control during normoxia and acute hypoxia in 0,75 gestation sheep. J. Soc. Gynecol. Investig., 2003, 10(5): 275

• 13.  F e r n a n d e z A.P., A l o n s o D., L i s a z o a i n I. e.a. Postnatal changes in the nitric oxide system of

  the rat cerebral cortex after hypoxia during delivery. Brain Res. Dev. Brain Res., 2003, 142(2): 177-192.

Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный ин-      Поступила в редакцию 27

ститут патологии, фармакологии и терапии ,                   сентября 2004 года

Воронежский государственный университет

ABOUT INTERRELATION BETWEEN PRODUCTION OF

NITRIC OXIDE AND S-NITROSOTHIOLS DURING THE PERIOD

OF EARLY POSTNATAL ADAPTATION OF CALVES

M.I. Retskii, S.S. Artem ’

S u m m a r y

The contents of oxide nitrogen stable metabolites (NO") and S-nitrosothiols (RSNO) in blood plasma at calves of the Simmental breed during early postnatal adaptation and at cows in blood plasma and amniotic fluid have been investigated. The possible biological role and importance of interaction of systems of NO^"generation and deposition to providing the adaptive reactions of newborn to new conditions of existence are discussed. It has been shown, that the first day after birth was characterized by the great level of stable metabolites of NO^", which is formed during prenatal development, and insignificant levels of RSNO in blood plasma. The negative correlation has been established between these parameters, which indicate on formation of NO^"pool in form of S-nitrosothiols at period of postnatal adaptation. At the end of the first month of life the contents both NO^"and RSNO became comparable to values, typical for adult animal.