Оценка биодоступности БАВ в составе биоактивных эмульсионных пищевых систем

На сегодняшний день большая часть научных исследований сосредоточена на разработке систем доставки биологически активных веществ (БАВ) в организм человека, их стабильности, защитных свойствах, органолептических характеристиках и пр. Не утрачивает своей актуальности и подтверждение биодоступности БАВ в различных системах их доставки, в том числе в составе пищевых продуктов.

Биодоступность – это сложный процесс, включающий желудочно-кишечное пищеварение, абсорбцию, метаболизм, распределение и биологическую активность [1]. Она определяется удельным весом вводимой дозы

БАВ, который попадает в кровоток (систему кровообращения) в неизмененном виде.

Функциональные свойства многих БАВ могут быть не реализованы в организме в связи с низкой или переменной биодоступностью после их употребления [2–4].

Поэтому биодоступность необходимо изучать для каждого конкретного БАВ в конкретной пищевой матрице, с целью выявления эффективного подхода к ее улучшению с учетом всех возможных факторов: системы доставки БАВ в организм человека, солюбилизации в желудочно-кишечном тракте, взаимодействия с другими компонентами, транспорта через клеточные мембраны и распределения через системное кровообращение в различные органы и ткани [5–8].

Пищевые матрицы эмульсионного типа являются одними из наиболее эффективных за счет возможности направленного контроля их состава, структуры и свойств [9–12]. Они расщепляются в желудочно-кишечном тракте с образованием коллоидных структур, что может способствовать увеличению биодоступности, абсорбции и/или трансформации БАВ.

Уровень витамина В12 в сыворотке крови является чувствительным маркером его алиментарного поступления в организм. Витамин В12 имеет сложный механизм всасывания в желудочно-кишечном тракте: в щелочной среде тонкой кишки под воздействием ферментов поджелудочной железы связывается с внутренним фактором – белком, образуя комплекс «внутренний фактор-белок», а рецепторы, расположенные на поверхности тонкой кишки, в свою очередь поглощают этот комплекс [13, 14]. В связи с этим он может выступать в качестве маркера для оценки эффективности различных систем доставки биологически активных веществ.

В связи с тем, что доклинические исследования биодоступности биологически активных веществ в пищевой матрице на лабораторных животных являются важным этапом в разработке технологии обогащенных пищевых продуктов, целью данной работы являлась сравнительная оценка биодоступности витамина В 12 в крови после введения биоактивной эмульсионной пищевой системы и прямой эмульсии, обогащенных данным витамином в сравнении с контролем – прямой эмульсией в опытах на лабораторных животных.

Материалы и методы исследования

Исследования проводили в клинике экспериментальных животных ФБУН ЕМНЦ ПОЗРПП Роспотребнадзора.

В качестве системы доставки БАВ в данном исследовании использовали биоактивные эмульсионные пищевые системы.

Биоактивная эмульсионная пищевая система (БЭПС) представляет собой эмульсионную пищевую систему, дополнительно обогащенную эмульсионным фортификатом – биоактивным дисперсным комплексом, содержащим в дисперсной фазе (среде) БАВ в количестве, превышающем его изначальное содержание в нем. В качестве БАВ в данном исследовании использовали витамин В 12 , инкапсулированный во внутреннюю водную фазу эмульсионного фортификата. Биоактивный дисперсный комплекс был фортифицирован в пищевую систему на основе воды.

В качестве маркера для определения биодоступности использовали витамин В 12 (циан-кобаламин) в виде кристаллического порошка, который вводился в исследуемые образцы пищевых эмульсий в количестве 0,12 мкг на 1 мл.

В эксперименте использовались 3 образца пищевых эмульсий, приготовленных на основе купажа масел (подсолнечного рафинированного дезодорированного и масла МСТ (смеси среднецепочечных триглицеридов) в соотношении 2:1)) и воды:

– образец № 1 – БЭПС с витамином В 12 ;

– образец № 2 – прямая эмульсия с витамином В12;

– контроль – прямая эмульсия.

Исследуемые образцы были расфасованы в пластиковую тару по 100 мл и хранились в холодильнике, за 1 час до введения доводились до комнатной температуры естественным путем.

Условия содержания лабораторных животных соответствовали нормативным документам:

– ГОСТ 33215-2014. Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила оборудования помещений и организации процедур;

– ГОСТ 33216-2014. Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила содержания и ухода за лабораторными грызунами и кроликами;

– РД-АПК 3.10.07.02-09. Рекомендательные документы. Методические рекомендации по содержанию лабораторных животных в вивариях научно-исследовательских институтов и учебных заведений;

– Европейская конвенция о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях. Страсбург, 18 марта 1986 год [15].

В качестве тест-объекта использовались белые лабораторные крысы-самцы линии Wistar. Животные содержались в помещении с контролируемыми условиями микроклимата, средняя температура за день не выходила за пределы нормы (16–22 °С) при относительной влажности воздуха 40–70 %, поддерживался 12-часовой цикл освещения.

Исследования проводились на животных массой 350 г ± 10 %, возраста 10–11 недель. Проведены мероприятия по карантину животных в течение 14 дней с тщательным осмотром ветеринарного врача на наличие отклонений по нормальному физиологическому развитию животных и диагностикой заболеваний кожи при помощи лампы Вуду на наличие паразитов. После проведения карантинных мероприятий животные рассаживались в клетки по 3 крысы (период адаптации 5 дней). Каждой группе животных присваивалась групповая метка. Осуществлены ежедневные мероприятия по кормлению животных с соблюдением питьевого режима. Еженедельно проводился мониторинг динамики массы тела животных. Ежедневно проводилась уборка помещений с применением дезинфицирующих средств.

Крысы имели беспрепятственный доступ к корму и воде. Смена подстила в клетках проводилась не реже 2 раз в неделю. Замена питьевой воды в бутылках осуществлялась ежедневно.

В день эксперимента у животных регистрировались показатели массы тела для определения точной дозировки эмульсии на животное. Всем животным натощак была введена эмульсия согласно групповой принадлежности из расчета 1 мл на каждые 100 грамм веса, при этом витамин В12 в соответствующих эмульсиях содержался в количестве 0,12 мкг в 1 мл. Введение эмульсий осуществлялось внутрижелудочным методом с помощью оральных зондов. Оценка биодоступности БАВ производилась по сыворотке крови лабораторных животных после введения БЭПС, содержащих во внутренней фазе БАВ в сравнении с контрольным образцом – прямой эмульсией и прямой эмульсией с добавлением БАВ.

Сбор цельной крови осуществлялся путем декапитации в пробирки с крышкой для определения содержания витамина В 12 .

Концентрацию витамина B12 в сыворотке измеряли с помощью автоматизированной системы электрохемилюминесцентного иммуноанализа.

Показатели общего анализа крови были получены на гематологическом анализаторе MicroCC-20Plus (Veterinary). Клетки ретикулоцитов в мазках крови были посчитаны на микроскопе Zeiss.

Статистическая обработка результатов исследований осуществлялась с использованием рангового критерия Манна-Уитни.

Результаты исследований

Исследования проводили в 2 этапа. На первом этапе (пилотный эксперимент) определяли оптимальный период биодоступности витамина В 12 с помощью анализа крови через 1, 2, 3 и 4 часа после введения образцов эмульсий. Результаты исследований представлены в табл. 1.

Исследования показали, что наибольшая концентрация витамина В12 определяется в сыворотке крови через 4 часа. В связи с этим оптимальным для определения биодоступности по результатам пилотного эксперимента был выбран период в 4 часа.

На втором этапе проводили анализ содержания витамина В12 в крови лабораторных животных через 4 часа после введения БЭПС, прямой эмульсии и контрольной эмульсии.

Результаты исследования крови лабораторных животных на количественное содержание витамина В 12 отражены в табл. 2.

Сравнительный анализ концентрации витамина В₁₂ в крови лабораторных животных через 4 часа после введения прямой эмульсии с витамином В 12 и БЭПС показал ее достоверное различие.

Далее были проведены исследования по выявлению различий в значениях параметров общего анализа крови лабораторных животных после введения БЭПС, прямой эмульсии и контрольной эмульсии (табл. 3 и 4).

С целью оценки биодоступности витамина В12 и включения его в метаболизм проведены исследования содержания основных гематологических параметров по общему анализу крови.

Таблица 1

Результаты определения оптимального периода концентрации витамина В 12 в сыворотке крови , после введения прямой эмульсии и БЭПС

Вид эмульсии	Концентрация витамина В 12 в сыворотке кро ви, пг/л
	через 1 час	через 2 часа	через 3 часа	через 4 часа
Контроль	600,67 ± 91,68	–	–	–
Прямая эмульсия с витамином В 12	616,67 ± 8,50	622,00 ± 133,76	627,33 ± 153,70	705,00 ± 102,59
БЭПС с витамином В12	647,33 ± 32,72	671,33 ± 127,70	672,67 ± 111,96	749,00 ± 120,40

Таблица 2

Результаты исследования крови лабораторных животных на содержание витамина В 12 через 4 часа после введения прямой эмульсии с витамином В 12 и БЭПС

Показатель	Прямая эмульсия с витамином В 12	БЭПС	Р-значение
Концентрация витамина B 12 , пг/мл	625,33 ± 111,83	690,0 ± 150,91	0,0487*

* Отличия статистически значимы на уровне 0,05.

Таблица 3

Результаты общего анализа крови через 4 часа после введения контрольной эмульсии и БЭПС

№	Показатель	Прямая эмульсия	БЭПС	Р-значение
1	Ретикулоциты, *10^9/л	0,95 ± 0,35	1,13 ± 0,65	0,580
2	WBC Лейкоциты, *10^9/л	2,85 ± 0,55	1,71 ± 0,52	0,012*
3	LYM Процент лимфоцитов, *10^9/л	1,90 ± 0,70	1,25 ± 0,46	0,088
4	MID (смесь содержания моноцитов, эозинофилов, базофилов и незрелых клеток), *10^9/л	0,23 ± 0,03	0,14 ± 0,02	0,022*
5	GRA (гранулоциты), *10^9/л	0,73 ± 0,76	0,33 ± 0,23	0,480
6	LYM (лимфоциты), %	67,50 ± 7,63	71,85 ± 5,16	0,617
7	MID (смесь содержания моноцитов, эозинофилов, базофилов и незрелых клеток, %	8,15 ± 2,95	8,43 ± 2,70	0,841
8	GRA (гранулоциты), %	24,33 ± 19,45	19,72 ± 12,58	0,689
9	RBC (эритроциты), *10^12/л	4,54 ± 0,12	4,64 ± 0,27	0,271
10	HGB (гемоглобин), г/л	83,00 ± 2,13	87,93 ± 2,34	0,030*
11	MCHC (средняя концентрация гемоглобина в эритроците), г/л	340,00 ± 5,89	346,07 ± 8,86	0,161
12	MCH (среднее содержание эритроцитов), пг	18,30 ± 0,97	18,96 ± 0,43	0,146
13	MCV (средний объем эритроцитов), 10–15/л	53,80 ± 2,01	54,80 ± 1,26	0,484
14	RDW-CV (индекс распределение тромбоцитов), %	11,05 ± 0,34	11,10 ± 0,33	0,920
15	RDW-SD (индекс распределение тромбоцитов), 10–15/л	27,95 ± 1,20	28,63 ± 0,89	0,249
16	HCT (гематокрит), %	24,40 ± 0,50	25,42 ± 0,36	0,040*
17	PLT (тромбоциты), *10^9/л	432,25 ± 24,76	444,33 ± 13,41	0,726
18	MPV (средний объем тромбоцитов), 10–15/л	6,28 ± 0,53	6,07 ± 0,33	0,480
19	PDW (индекс распределения тромбоцитов), 10–15/л	11,68 ± 0,35	11,71 ± 1,05	0,550
20	PCT (тромбокрит), %	0,26 ± 0,04	0,26 ± 0,02	0,617
21	P-LCR, %	3,80 ± 2,16	3,83 ± 3,46	0,341

* Отличия статистически значимы на уровне 0,05.

Таблица 4

Результаты общего анализа крови лабораторных животных через 4 часа после введения прямой эмульсии с витамином В 12 и БЭПС

Как видно из табл. 3, по сравнению с прямой эмульсией после введения лабораторным животным БЭПС количество лейкоцитов, моноцитов, эозинофилов, базофилов, незрелых клеток, а также содержание гемоглобина и гематокрита стало достоверно больше.

Сравнительный анализ показателей общего анализа крови лабораторных животных через 4 часа после введения прямой эмульсии с витамином В 12 и БЭПС представлен в табл. 4.

Результаты сравнительного анализа также свидетельствуют о достоверном увеличении количества клеток белых кровяных телец

(лейкоцитов и лимфоцитов), а также тромбоцитов после введения БЭПС по сравнению с их количеством после введения прямой эмульсии с витамином В12.

Таким образом, при сравнении результатов анализа крови лабораторных животных после введения прямой эмульсии с витамином В₁₂ и БЭПС (см. табл. 4) альтернативная гипотеза о наличии различий между данными принимается по изучаемому признаку на уровне значимости p = 0,05 для следующих показателей: количество витамина В 12, количество белых кровяных телец – лейкоцитов

№	Показатель	Прямая эмульсия с витамином В 12	БЭПС	Р-значение
1	Ретикулоциты, *10^9/л	1,23 ± 0,53	1,13 ± 0,65	0,603
2	WBC Лейкоциты, *10^9/л	1,37 ± 0,11	1,71 ± 0,52	0,0327*
3	LYM Процент лимфоцитов, *10^9/л	1,03 ± 0,46	1,25 ± 0,46	0,088
4	MID (смесь содержания моноцитов, эозинофилов, базофилов и незрелых клеток), *10^9/л	0,17 ± 0,33	0,14 ± 0,02	0,414
5	GRA (гранулоциты), *10^9/л	0,47 ± 0,37	0,33 ± 0,23	0,336
6	LYM (лимфоциты), %	60,54 ± 6,38	71,85 ± 5,16	0,0178*
7	MID (смесь содержания моноцитов, эозинофилов, базофилов и незрелых клеток, %	9,27 ± 3,71	8,43 ± 2,70	0,3
8	GRA (гранулоциты), %	26,19 ± 13,08	19,72 ± 12,58	0,12
9	RBC (эритроциты), *10^12/л	4,57 ± 0,25	4,64 ± 0,27	0,74
10	HGB (гемоглобин), г/л	86,60 ± 3,46	87,93 ± 2,34	0,369
11	MCHC (средняя концентрация гемоглобина в эритроците), г/л	348,47 ± 9,47	346,07 ± 8,86	0,52
12	MCH (среднее содержание эритроцитов), пг	19,04 ± 0,76	18,96 ± 0,43	0,818
13	MCV (средний объем эритроцитов), 10–15/л	54,63 ± 1,68	54,80 ± 1,26	0,983
14	RDW-CV (индекс распределение тромбоцитов), %	11,07 ± 0,38	11,10 ± 0,33	0,437
15	RDW-SD (индекс распределение тромбоцитов), 10–15/л	28,53 ± 1,02	28,63 ± 0,89	0,803
16	HCT (гематокрит), %	24,92 ± 1,32	25,42 ± 0,36	0,171
17	PLT (тромбоциты), *10^9/л	418,93 ± 10,65	444,33 ± 13,41	0,0387*
18	MPV (средний объем тромбоцитов), 10–15/л	6,05 ± 0,22	6,07 ± 0,33	0,866
19	PDW (индекс распределения тромбоцитов), 10–15/л	11,47 ± 0,63	11,71 ± 1,05	0,947
20	PCT (тромбокрит), %	0,26 ± 0,03	0,26 ± 0,02	0,678
21	P-LCR, %	4,55 ± 3,22	3,83 ± 3,46	0,299

* Отличия статистически значимы на уровне 0,05.

(WBC) и количество лимфоцитов (LYM %) и число тромбоцитов (PLT). При сравнении результатов анализа крови лабораторных животных после введения прямой эмульсии и БЭПС (см. табл. 3) нулевая гипотеза об отсутствии различий между данными принимается (p = 0,05) по всем исследуемым показателям, кроме количества белых кровяных телец – лейкоцитов (WBC), смеси содержания моноцитов, эозинофилов, базофилов и незрелых клеток (MID#), концентрации гемоглобина (HGB) и гематокрита (HCT). При сравнении значений WBC, MID#, HGB, HCT принимается альтернативная гипотеза о существовании различий по изучаемому признаку.

Количественное содержание витамина В 12 в крови лабораторных животных, получавших БЭПС, на 10,4 % превышает его содержание в крови лабораторных животных, получавших прямую эмульсию с данным витамином. Контрольная группа животных, получавшая эмульсию без витамина, характеризовалась содержанием витамина В₁₂ в крови в количестве, меньшем на 33 % по сравнению с группой, получавшей БЭПС. При этом у контрольной группы животных наблюдались более низкие значения гемоглобина и гематокрита. Это подтверждает эффективность при-

менения витамина В12 для процессов деления, роста и созревания клеток, в частности лейкоцитов, тромбоцитов, участвующих в клеточном и тканевом обмене [16, 17], что способствует улучшению сопротивляемости организма, а повышение уровня гемоглобина – насыщению организма кислородом и профилактике гипоксии тканей.

Заключение

На основе полученных результатов можно считать, что инкапсулирование витамина В 12 во внутреннюю водную фазу фортификата БЭПС обеспечивает большую его биодоступность в сравнении с прямой эмульсией, обогащенной данным витамином. Данные анализа крови лабораторных животных подтверждают, что под воздействием витамина В₁₂ происходят процессы, в разной степени способствующие улучшению сопротивляемости организма к различным факторам и формированию новых клеток. Научно-практическое значение доклинической оценки биодоступности БАВ заключается в подтверждении эффективности применения конкретного БАВ в конкретной пищевой матрице и является инновационным, современным и эффективным направлением профилактики алиментарных заболеваний.