Оценка функционально-пробиотического потенциала кисломолочных напитков, ферментированных лактобациллами из растительной закваски

В современных условиях развития молочной промышленности особое внимание уделяется созданию функциональных продуктов питания с пробиотическими свойствами. Пробиотики на основе молочнокислых бактерий способствуют нормализации микробиоты кишечника, повышению неспецифической резистентности организма и профилактике желудочно-кишечных заболеваний [1, 2].

Традиционно в качестве заквасок для кисломолочных продуктов используют штаммы, выделенные из молочной среды или желудочнокишечного тракта. В последние годы всё больший интерес вызывают лактобациллы, выделенные из ферментированной растительной среды – квашеных овощей, травяных заквасок, солений [3, 4]. Такие микроорганизмы часто обладают высокой кислотообразующей и антагонистической активностью, а также устойчивостью к неблагоприятным факторам окружающей среды [5, 6].

Молочная сыворотка является крупнотоннажным побочным продуктом производства сыра и творога. Её переработка – актуальная задача для молочной отрасли. Использование сыворотки в качестве основы для ферментации пробиотическими штаммами позволяет получать функциональные напитки с высокой биологической ценностью, одновременно решая вопрос утилизации вторичного сырья [7, 8].

Цель исследований – оценка функционально-пробиотического потенциала кисломолочных напитков на основе молочной сыворотки, ферментированных штаммами лактобацилл, выделенными из растительной закваски.

Методика и методы исследования. Объекты исследования:

• 1.    штамм Lactiplantibacillus plantarum ТВ-08, выделенный из образца ферментированной капустной закваски;

• 2.    штамм Lacticaseibacillus rhamnosus ТВ-15, выделенный из образца ферментированной травяной смеси;

• 3.    кисломолочный напиток на основе пастеризованной молочной сыворотки (pH 6,2±0,2, титруемая кислотность 18±2 °Т), ферментированный исследуемыми штаммами при температуре 37±1 °C в течение 16 часов до достижения титра 1,0×10⁹ КОЕ/мл. Для экспериментов с повышенной дозой использовали концентрат с титром 5,0×10⁹ КОЕ/мл;

• 4.    контрольный образец – стерилизованная молочная сыворотка без закваски;

• 5.    референтный пробиотический штамм – Lacticaseibacillus rhamnosus GG;

• 6.    тест-культуры патогенных микроорганизмов: Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella Typhimurium.

Суточные культуры лактобацилл центрифугировали, осадок ресуспендировали в физиологическом растворе с pH 2,0 (корректировка 1M HCl). Концентрацию клеток доводили до 1×10⁸ КОЕ/мл. Инкуба- цию проводили при 37 °C в течение 180 мин. Отбор проб осуществляли через 0, 60, 120 и 180 мин. Выживаемость определяли высевом на MRS-агар с последующим подсчётом колоний [9].

Устойчивость к желчным солям оценивали следующим образом: культуры лактобацилл в концентрации 1×10⁸ КОЕ/мл вносили в среду MRS с добавлением 0,5% бычьей желчи. Инкубация при 37 °C в течение 4 ч. Отбор проб каждые 2 ч. Выживаемость оценивали по разнице в титре [10].

Антагонистическую активность определяли путем посева в чашки Петри с агаром Мюллера–Хинтона суточных культур тест-микроорганизмов (1×10⁶ КОЕ/мл). В агаре делали лунки диаметром 8 мм, в которые вносили по 100 мкл исследуемого кисломолочного напитка. Чашки инкубировали при 37 °C в течение 24 ч. Антагонистическую активность оценивали по диаметру зоны задержки роста тест-культуры [11].

Все эксперименты проводили в трёх повторностях. Данные представлены как среднее арифметическое ± стандартная ошибка среднего (M±m). Статистическую значимость различий между группами оценивали с помощью однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с критерием Тьюки. Различия считали статистически значимыми при p<0,05. Обработку выполняли в программе Statistica 12.0.

Результаты исследований

Ферментация молочной сыворотки исследуемыми штаммами завершалась через 16 ч. Титруемая кислотность готового напитка с штаммом ТВ-08 составила 82±2 °Т, с штаммом ТВ-15 – 78±2 °Т, pH – 4,3±0,1. Контрольный образец (без закваски) имел кислотность 18±2 °Т. Результаты оценки выживаемости штаммов при pH 2,0 представлены в таблице 1.

Таблица 1 – Выживаемость лактобацилл (%) после инкубации при pH 2,0 (M±m, n=3)

Штамм        60 мин       120 мин       180 мин

L. plantarum ТВ08	95,4±1,2	88,6±1,5	84,3±1,4
L. rhamnosus ТВ15	93,8±1,5	85,2±1,6	78,4±1,5
L. rhamnosus GG (референт)	91,2±1,4	82,5±1,5	75,6±1,6

Установлено, что штамм L. plantarum ТВ-08 проявляет наибольшую устойчивость к кислой среде: через 180 мин выживаемость составила 84,3%, что выше показателя референтного штамма на 8,7%.

Результаты оценки выживаемости штаммов в присутствии 0,5% желчи представлены в таблице 2.

Таблица 2 – Выживаемость лактобацилл (%) в присутствии 0,5% желчи (M±m, n=3)

Штамм	2 ч	4 ч
L. plantarum ТВ-08	96,2±1,1	91,5±1,3
L. rhamnosus ТВ-15	94,5±1,3	88,4±1,4
L. rhamnosus GG (референт)	92,8±1,3	85,6±1,5

Все исследуемые штаммы сохраняли высокую жизнеспособность в присутствии желчных солей. Штамм ТВ-08 показал наилучший результат. Через 4 часа выживаемость составила 91,5%, что выше референтного штамма на 5,9%.

Результаты оценки антагонистической активности кисломолочных напитков в отношении тест-культур представлены в таблице 3.

Таблица 3 – Зоны задержки роста тест-культур (мм) (M±m, n=3)

Образец	E. coli	S. aureus	Salmonella Typhimurium
Контроль (стерильная сыворотка)	0	0	0
Референт (LGG, 1×)	15,2±0,5	16,4±0,6	14,8±0,5
ТВ-08 (1×)	18,4±0,6	19,2±0,7	17,6±0,5
ТВ-15 (1×)	16,5±0,5	17,3±0,6	15,9±0,5
Смесь ТВ-08+ТВ-15 (1×)	17,6±0,6	18,4±0,6	16,8±0,6
ТВ-08 (5×)	21,2±0,7	22,4±0,8	20,5±0,7
Смесь (5×)	19,8±0,6	20,5±0,7	18,9±0,6

Контрольный образец (стерильная сыворотка без закваски) антагонистической активности не проявил. Напиток, ферментированный штаммом ТВ-08 в концентрации 5×10⁹ КОЕ/мл, показал максимальную активность в отношении всех тест-культур. Зоны задержки роста составили: для E. coli – 21,2 мм, для S. aureus – 22,4 мм, для Salmonella Typhimurium – 20,5 мм.

Отмечен дозозависимый эффект: увеличение концентрации лактобацилл в напитке с 1×10⁹ до 5×10⁹ КОЕ/мл привело к повышению антагонистической активности на 15–18%.

Обсуждение

Проведенные исследования показали, что кисломолочные напитки на основе молочной сыворотки, ферментированные лактобациллами из растительной закваски, обладают свойствами, характерными для эффективных пробиотических продуктов.

Устойчивость к кислой среде является критическим параметром для пробиотиков, поскольку при прохождении через желудок микроорганизмы должны выдерживать pH 1,5 – 3,0 в течение 1 – 3 часов [9]. Штамм L. plantarum ТВ-08 показал высокую кислотоустойчивость (84,3% выживаемости через 3 часа), что сопоставимо с лучшими коммерческими пробиотиками.

Способность выживать в присутствии желчных солей (0,5% желчи) обеспечивает прохождение бактерий через тонкий кишечник [10]. Штамм ТВ-08 сохранял 91,5% жизнеспособности после 4 часов инкубации, что превышает показатели референтного штамма.

Антагонистическая активность в отношении патогенных и условнопатогенных микроорганизмов (E. coli, S. aureus, Salmonella) подтверждает потенциал разработанных напитков для профилактики кишечных инфекций [11]. Особенно важно, что активность проявлялась не только в отношении грамотрицательных, но и грамположительных бактерий.

Выявленный дозозависимый эффект (увеличение титра закваски с 1×10⁹ до 5×10⁹ КОЕ/мл) позволяет технологически регулировать пробиотическую активность готового продукта.

Использование молочной сыворотки в качестве основы решает одновременно две задачи - утилизацию крупнотоннажного вторичного сырья и создание функционального продукта с высоким содержанием сывороточных белков, минеральных веществ и витаминов [7, 8].

Выводы

• 1.    Штаммы L. plantarum ТВ-08 и L. rhamnosus ТВ-15, выделенные из ферментированной растительной закваски, обладают высокой устойчивостью к факторам, моделирующим желудочно-кишечный тракт: выживаемость при pH 2,0 через 3 часа составила 84,3% и 78,4% соответственно, в присутствии 0,5% желчи через 4 часа – 91,5% и 88,4%.

• 2.    Кисломолочный напиток на основе молочной сыворотки, ферментированный штаммом L. plantarum ТВ-08 в концентрации 5×10⁹ КОЕ/ мл, проявляет выраженную антагонистическую активность в отношении тест-культур: зона задержки роста E. coli – 21,2 мм, S. aureus – 22,4 мм, Salmonella Typhimurium – 20,5 мм.

• 3.    Выявлен дозозависимый эффект: увеличение титра лактобацилл в напитке с 1×10⁹ до 5×10⁹ КОЕ/мл сопровождается повышением антагонистической активности на 15 – 18%.

• 4.    Экспериментальные образцы кисломолочных напитков на основе молочной сыворотки, ферментированные штаммами L. plantarum ТВ-08 и L. rhamnosus ТВ-15, проявляют свойства, характерные для пробиотических продуктов, и могут быть рекомендованы для дальнейших технологических и клинических исследований.