Оценка раневой поверхности и регенерации тканей при применении хлорофилла и гемина в свободной и полимерной формах

Funding: the study was supported by the State Contract "Dynamics of Elementary Processes in Complex Chemical and Biological Systems" (FFZE-2025-0025).

Введение Одними из широко распространенных травм, встречающихся у сельскохозяйственных животных, являются раны кожного покрова разного генеза [1, 2]. Так, например, овцам раны могут быть нанесены ножницами или электрическими машинками в процессе стрижки [3]. R. Lardy и соавторы отмечали большой процент случаев травматизма кожи крупного рогатого скота в области шеи, плеч, спины и запястий при неправильной организации конструкций самоблокирующихся ограждений [4]. Серьезным фактором возникновения ран у домашней птицы в период яйцекладки представляется расклев перьев [5]. В кролиководческих хозяйствах травмы кожи возникают в результате агрессивного поведения окотившихся крольчих, а также иерархических драк [6]. Лошади наиболее часто травмируют дистальные отделы конечностей во время выпаса. Такие раны довольно опасны и требуют интенсивного лечения [7].

На протяжении многих лет для заживления ран широко практикуется использование защитных марлевых, хлопковых и льняных повязок, содержащих регенеративные средства [8, 9]. Кроме того, высокую эффективность демонстрируют препараты на основе полисахаридов в различных лекарственных формах (гели, повязки и т. д.). Так, A. Gope и соавторы сообщили о безрубцовом заживлении ран под воздействием альгинатного гидрогеля, смешанного с медом Джамун и топленым маслом. Полученный препарат также обладал выраженным антибактериальным эффектом [10]. В работе Mi Wu и соавторов приведены данные по разработке повязки на основе полисахаридов – полиионов хитозана и гиалуроновой кислоты. Повязка обладала такими полезными свойствами, как высокая адгезия к раневым поверхностям (в том числе неправильной формы) и быстрая стимуляция заживления ран [11]. Гель на основе другого широко известного полисахарида – хитозана – продемонстрировал высокую эффективность при лечении хронических ран [12]. В последнее время определенный интерес вызывают регенеративные свойства экстрактов различных растений [13–17]. Также хорошие результаты показывают макроциклические соединения – порфирины, которые обладают антимикробным действием [18, 19]. Известно, что заживление ран может быть осложнено развитием в них воспалительных процессов, вызванных различными микроорганизмами, поэтому в данном ас- пекте указанные свойства порфиринов крайне важны. Перспективность их применения в лечебных целях обусловлена как увеличением числа антибиотикоустойчивых штаммов, так и вступившим в силу требованием Россельхознадзора о рецептурном отпуске антимикробных ветеринарных препаратов [20–22].

Для примера: доказано, что экстракт крапивы ускоряет пролиферацию клеток через 24 часа на 39 и 30 % соответственно по сравнению с контрольными клетками. Было установлено, что экстракт обладает противовоспалительными и умеренными антиоксидантными свойствами, что повышает его общий потенциал в заживлении ран [23].

Поли- N -винилпирролидон (ПВП) является водорастворимым синтетическим полимером, применяемым в качестве заменителя плазмы и крови и основы для создания мазевой основы. Данный полимер обладает низкой токсичностью, химической стабильностью и хорошей биосовместимостью [24].

Цель исследований – проведение сравнительной оценки репаративных свойств крапивного экстракта, содержащего макрогетероцикл – хлорофилл (Chl), и соединения того же класса – гемина – как в свободной, так и в полимерной форме на модели «резаная рана».

Задачи: провести детекцию и анализ Chl, содержащегося в экстракте крапивы, спектрофотометрическим методом; проанализировать чистоту субстанции гемина с помощью ВЭЖХ; подтвердить связывание Chl и гемина с полимерной матрицей; оценить степень репарации по фазам течения при применении изучаемых полимерных и свободных форм Chl и гемина; произвести расчет площади раневой поверхности для объективной оценки ее репарации.

Объекты и методы. Объекты исследования – Chl, содержащийся в экстракте крапивы двудомной ( Urtica dioica ), и гемин, как в свободной форме, так и в составе полимерной матрицы поли- N -винилпирролидона (ПВП). Структурные формулы указанных соединений представлены на рисунке 1.

Рис. 1. Структурные формулы Chl (а), гемина (б) и ПВП (в) Chl (a), hemin (б) and PVP (в) structures

Анализ соединений и получение их полимерных форм осуществлялись в ФИЦ химической физики им. Н.Н. Семенова РАН. Исследования in vivo проводились на базе Удмуртского НИИСХ – структурного подразделения Удмуртского ФИЦ УрО РАН с апреля по май 2024 г.

Экстракт крапивы был получен методом экстракции из сухих листьев крапивы в условиях кавитационного режима [15]. Количественное содержание Chl в экстракте определялось спектрофотометрически с помощью UV-Vis-NIR спектрофотометра (ПЭ5400УФ, «Экрохим», Россия). Данные регистрации электронных абсорбционных спектров были обработаны с помощью прог- раммного обеспечения SC5400 (версия 2.1). Построение калибровочной кривой (по аналитическим стандартам (АС) Chla и Chlb с чистотой > 99,5 %, Sigma-Aldrich, США) и проведение количественного анализа Chl было выполнено с помощью программного обеспечения QA5400 (версия 2.1).

Чистота использованной в эксперименте субстанции гемина (BioFroxx, Германия) подтверждалась хроматографически. Для сравнения использовался АС гемина (чистота > 99,5 %, Sigma-Aldrich, США).

Условия проведения хроматографии представлены в таблице 1.

Таблица 1

Условия хроматографии гемина

The chromatography's conditions of hemin

Вид хроматографии	Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ)
Хроматограф	Shimadzu LC-20 Prominence (Япония)
Детектор	Диодная матрица (DAD)
Колонка	Primesep 100 (150 × 4,6 мм, 5 мкм)
Режим	Изократический
Подвижная фаза	Ацетонитрил: вода в соотношении 70:30 (об.%)
Рабочая длина волны	393 нм
Скорость потока	1,0 мл/мин
Время удерживания пика	5,76 мин

Для построения калибровочной кривой из АС гемина готовили рабочие растворы с концентрациями: 50,0; 25,0; 12,5; 6,25 и 3,125 мкг/мл.

Получение полимерных форм и изучение их связывания с ПВП проводилось согласно методам, подробно изложенным в статье [13].

Эксперименты in vivo и оценка регенерации раневой поверхности проводились на беспо- родных мышах согласно протоколу, подробно описанному в статье [25], а также положениям международной конвенции [26]. В каждой группе было по 5 животных. На рисунке 2 представлен вид экспериментального разреза.

Схема эксперимента представлена ниже (табл. 2).

Рис. 2. Резекция участка ткани вдоль позвоночника лабораторной мыши Resection of a tissue section along the spine of a laboratory mouse

Таблица 2

Схема эксперимента The scheme of the experiments

Группа	Препарат	Объем, мкл
Контрольная (К)	Интактные	–
1-я опытная	Chl-ПВП	200
2-я опытная	Chl
3-я опытная	Гемин-ПВП
4-я опытная	Гемин

Терапия была начата на 1-е сут постоперационного дня. Ежедневно наносили препараты в объеме 200 мкл (дозировка – 200 мкг). В ходе эксперимента оценивали общее состояние животных, двигательную активность, состояние раневой поверхности по фазам течения (воспаление, регенерация, эпителиализация) планиметрическим методом [19].

Для расчета площади раны применяли формулу

S = L ∙ W ∙ 0,785, где L – длина раны; W – ширина раны.

Сравнительную оценку фаз раневого течения в экспериментальных группах проводили путем анализа состояния животных и линейной оценки размера дефекта. Срок эксперимента – 21 день.

Статистический анализ проводился с использованием программного обеспечения MS Excel – 2010. Различия в средних значениях определялись с помощью t -критерия Стьюдента с уровнем значимости p ≤ 0,05. Результаты выражены как M±SD, где M – средние значения, SD – стандартные отклонения.

Результаты и их обсуждение. Проведение спектрофотометрического анализа крапивного экстракта показало характерное поглощение Chl при λ max = 650 нм (рис. 3, а ). На рисунке 3, б , представлена калибровочная кривая, по которой проводился расчет содержания Chl в экстракте, с учетом разбавлений.

Рис. 3. Спектр поглощения Chl, содержащегося в крапивном экстракте (а), калибровочная кривая АС Chl (б)

Absorption spectrum of Chl contained in nettle extract (a), calibration curve of AC Chl (б)

При проведении хроматографии субстанции гемина было установлено, что профиль пика и время его выхода и АС были идентичны (рис. 4).

Чистота гемина, рассчитанная на основе калибровочной кривой (рис. 5), составила 98,2 %.

Рис. 4. Хроматограммы АС гемина (а) и испытуемого образца (б) Chromatograms of AS hemin (a) and the test sample (б)

Рис. 5. Калибровочная кривая АС гемина The calibration curve of AS hemin

Связывание Chl и гемина с ПВП подтверждалось путем регистрации электронных абсорбционных спектров полученных полимерных форм и их сравнения со спектрами соединений в свободной форме (рис. 6).

Рис. 6. Электронные абсорбционные спектры поглощения Chl и Chl-ПВП (а), гемина и гемин-ПВП (б) Electronic absorption spectra of Chl and Chl-PVP (a), hemin and hemin-PVP (б)

Представленные рисунки демонстрируют снижение оптической плотности, а также уширение полос в спектрах поглощения Chl и гемина. Это может свидетельствовать о нековалентном связывании исследуемых веществ с полимером. Как ранее нами было установлено, включение действующих веществ в полимерные носители обусловливает их постепенное высвобождение из матрицы и, как следствие, усиление антибактериального эффекта – вероятно, за счет пролонгированного действия [14, 17].

В предыдущих исследованиях нами были изучены антимикробные свойства Chl и гемина в отношении S. aureus и E. coli, которые относятся к условно-патогенным микроорганизмам и, как известно, колонизируют слизистые оболочки и эпителий млекопитающих [18–20]. Было установлено, что в дозировках 75 и 160 мкг (Chl и гемин соответственно) препараты в обеих формах проявляли стойкий бактериостатический эффект. Так как рана является воротами инфекции, то в целях подавления потенциального роста бактерий была взята несколько бóльшая дозировка препаратов для проведений испытаний in vivo.

В экспериментах с участием животных был проведен комплексный анализ процесса репарации покровных тканей под воздействием разных вариантов действующих веществ в свободных и полимерных формах. Результаты сравнительного анализа фаз раневого течения представлены на рисунке 7.

Рис. 7. Фазы течения раневого процесса (визуальная оценка, балл) Phases of the wound healing process (visual assessment, score)

Из рисунка 7 видно, что по всем фазам течения наблюдалась равномерность воспалительнорепаративного процесса у всех опытных мышей. Первая фаза воспалительного процесса протекала во всех группах по классическому типу с выраженными покраснением и отеком. Однако применяемый в 1-й опытной группе Chl-ПВП демонстрировал высокую противовоспалительную активность в сравнении с другими группами. Гнойные поражения были обнаружены лишь в контрольной и 2-й опытной группе у отдельных особей. В 3-й и 4-й опытных группах лабораторных мышей отмечены выраженные процессы снижения выделения экссудата по сравнению с контрольной группой.

Во второй фазе (регенерация) по визуальным наблюдениям эффект уменьшения выделения экссудата также выраженно наблюдался в 1-й и 3-й опытных группах мышей, грануляция

Вестник КрасГАУ. 2025. № 10 (223) тканей здесь была значительно меньше. Раневая поверхность затягивалась равномерно во всех изучаемых группах, при этом в 1-й и 3-й опытных группах данный процесс протекал более интенсивно.

Процессы регенерации в группах подопытных животных с добавлением полимерных форм Chl и гемина демонстрировали разительное отличие от контроля. Схожие визуальные оценки по всем трем фазам отмечались у 2-й и 4-й опытных групп. На протяжении всего эксперимента активность и подвижность животных всех опытных групп сохранялась в пределах физиологической нормы. Потребление воды и пищи также оставались в пределах нормы.

Для объективной оценки заживления были произведены замеры площади раневой поверхности в динамике. Результаты представлены в таблице 3.

Таблица 3

Сутки	Контрольная	1-я опытная	2-я опытная	3-я опытная	4-я опытная
1-е	3	3	3	3	3
5-е	2,22±0,18	1,58±0,23	2,21±0,24	1,73±0,1**	1,73±0,08**
Cv, %	16,13	25,06	31,92	22,78	12,80
7-е	1,81±0,21	1,07±0,16**	1,18±0,14	2,07±0,22	1,69±0,20**
Cv, %	22,90	23,36	29,94	23,30	25,84
9-е	1,49±0,35	0,84±0,26	1,07±0,16	1,33±0,17	1,15±0,12
Cv, %	27,39	32,93	29,94	28,40	24,30
11-е	0,65±0,21	0,28±0,04**	0,57±0,25	0,56±0,1	1,33±0,17
Cv, %	23,50	27,01	27,20	28,39	29,36
13-е	0,56±0,19	0,13±0,04	0,41±0,24	0,31±0,12	0,64±0,13
Cv, %	26,86	19,75	25,76	26,26	27,76
15-е	0,5±0,19	0,07±0,01	0,30±0,12	0,22±0,12	0,65±0,15
Cv, %	25,31	21,80	32,85	22,72	25,40
18-е	0,39±0,17	0,01±0,01	0,22±0,14	0,08±0,05	0,28±0,09
Cv, %	18,46	25,59	33,14	32,05	32,00
21-е	0,06±0,02	0	0	0	0
Cv, %	28,46	0	0	0	0

Примечание : ** При сравнительном анализе с контролем р ≤ 0,05.

Динамика площади раны во времени, см2

Dynamics of the wound area over time, cm2

На 5-е сут в 1-й опытной группе площадь раневой поверхности сократилась на 28,8 %, процессы инфильтрации отсутствовали (рис. 8). В опытной группе с обработкой гемин-ПВП и гемином в свободной форме (3-я и 4-я опытные группы соответственно) площадь раны досто- верно сократилась на 22 %. Для демонстрации и наглядности процесса заживления представлены фотографии динамики регенерации тканей (см. рис. 8).

На 7-е сут в контроле была видна внешняя часть раневой поверхности с сохранением плотного струпа. В 1-й группе сокращение поверхности ран было наиболее интенсивным из опытных групп - достоверно на 40,8 %. Во 2-й опытной группе площадь раны сократилась на 35 %, наблюдались раны без образования струпа с низкой грануляцией тканей. В 3-й опытной группе мышей наблюдалось увеличение площади раневой поверхности на 14 %, у мышей 4-й опытной группы результат достоверного уменьшения площади раневой поверхности составил 6,6 %.

На 9-е сут у мышей контрольной группы наблюдалась сухая раневая поверхность. При этом у 20 % животных была отмечена значительная для данного этапа площадь поверхности раны. Сокращение раневой поверхности у данных подопытных животных наблюдалось в пределах 17 % по сравнению с предыдущими показаниями на 7-е сут. В 1-й опытной группе выявлен минимальный размер площади раневой поверхности, что на 43,6 % меньше, чем в контрольной группе. В данной группе наблюдались ровные и сухие края ран, раневая поверхность была вытянутой формы, отмечалось натяжение по линии разреза. Во 2-й опытной группе имелись плотные струпы, по поведенческим реакциям наблюдалось выраженное внимание к ранам, что, вероятно, провоцировал зуд раневой поверхности. Рана была визуально не вытянутой, а овальной формы, что указывало на недостаточное натяжение. Имелись мокрые раны, при этом площадь раны была меньше контроля на 28 %. В 3-й опытной группе выявлен струп с образованием фибринового сгустка, площадь ран уменьшилась на 35 %. Были выявлены незначительные очаги локального воспаления, в целом эпитализация завершена, виден рубец. Края заживления были неровные, вырос подшерсток. Аналогичная ситуация наблюдалась в 4-й опытной группе.

На 11-е сут в 1-й опытной группе площадь раневой поверхности сократилась на 56 %, натяжение ран значительное. Околораневая поверхность значительно обросла подшерстком, что подтверждало достаточную регенерацию тканей и восстановление эпителия с волосяным покровом. Отмечалась низкая грануляция тка- ней. У мышей 2-й опытной группы околораневая поверхность была без волосяного покрова. Выявлена высокая степень грануляции тканей. При применении гемина отмечалось недостаточное смыкание краев ран. Площадь раны была в 2 раза больше контрольных значений. При этом следует отметить, что в группе отмечалась положительная динамика регенерации тканей.

На 13-е сут в контроле отмечалось уменьшение площади на 13,8 % по сравнению с 11-ми сут. В 1-й опытной группе края раневой поверхности практически сомкнулись и были видны следы раневого процесса, у 25 % мышей отмечался струп. Площадь раны сократилась в 4,3 раза. Во 2-й опытной группе по-прежнему наблюдалась раневая поверхность значительной площади, волосяной покров отсутствовал. В 3-й группе наблюдалось значительное уменьшение площади раны - на 44,6 %. У мышей 4-й опытной группы наблюдалась положительная динамика регенерации тканей. Площадь ран резко сократилась - на 51 % по сравнению с данными 11 -х сут.

На 15-е сут у мышей контрольной группы края раны ровные, площадь составила 0,5 см2, что на 10,7 % меньше раны 13-х суток. В 1-й опытной группе отмечается разительная разница - края раны сомкнулись, фаза эпитализации завершена быстрее всех остальных групп.

К 18-м сут в контрольной группе площадь раны сократилась на 22 %, при этом сохранялась открытая рана. В 1-й опытной группе шерсть полностью закрыла места раны. У мышей 2-й опытной группы раневая поверхность и возле нее не обросли шерстью, были видны края рубца. У мышей 3-й опытной группы площадь раны сократилась на 79 % по сравнению с контролем. В 4-й опытной группе место раны заросло шерстью.

На 21-е сут во всех группах образовался выраженный рубец. В 1-й и 3-й группах произошло заживление по нормотрофическому типу. В 4-й опытной группе - неровное натяжение, имелись следы рубцевания. В контроле наблюдалось заживление без этапа рубца.

Рис. 8. Динамика течения раневого процесса The dynamic of the wound healing process

Предоставленные результаты позволили в комплексе объективно и наглядно оценить полученные данные по цифровому материалу и визуальной оценке фотографий. В результате динамического сокращения раневой поверхности во всех группах регенерация проходила с значительным прогрессом регенерации тканей при нанесении Chl-ПВП и гемин-ПВП.

Экстракт крапивы двудомной (Urtica dioica) перспективен для применения в качестве репаративного средства, так как это легкодоступное сырье, произрастающее во многих странах мира [27, 28]. Состав крапивы многокомпонентен, в т. ч. известно, что в ее листьях содержится до 5 г/кг макрогетероцикла – Chl [27]. Другой представитель этого класса соединений, гемин, широко используется для лечения дефицита гема [29, 30]. Ранее нами было показано противо-микробное действие обоих соединений в свободной и полимерной формах [31–33]. В настоящей работе было установлено, что оба макрогетероцикла проявляют более выраженные репаративные свойства в составе матрицы ПВП, что согласуется с предыдущими данными. Высокая активность крапивного экстракта также может быть усилена некоторыми содержащи- мися в нем веществами, такими как хлорофилл, флавоноиды и др.

Заключение. В совокупности с клиническими факторами заживления раны полимерные Chl и гемин повышают репаративную активность тканей. Исходя из полученных данных, сделаны следующие выводы:

• 1.    С помощью метода спектрофотометрии было подтверждено присутствие Chl в экстракте крапивы двудомной, а также рассчитана его концентрация.

• 2.    Используемая субстанция гемина характеризовалась высокой чистотой (более 98 %) и поэтому была задействована в дальнейших экспериментах.

• 3.    Было показано наличие взаимодействия Chl и гемина с полимерной матрицей ПВП, которое потенциально может обусловливать пролонгированное действие препаратов.

• 4.    Высокая степень репарации отмечалась в 1-й и 3-й опытных группах подопытных животных, заживление было по нормотрофическому типу. Средняя степень отмечалась во 2-й и 4-й группах. Полученные результаты могут объясняться положительным влиянием пролонгированного действия полимерных форм.

• 5.    В 1-й и 2-й группах на 2-е сутки степень сокращения площади раневой поверхности была больше, чем в 3-й и 4-й опытных группах, а на 5-е сут. – больше, чем в контрольной группе. На 21-е сут. у мышей опытных групп заживление раневой поверхности завершено.

Таким образом, полимерная форма Chl и гемина продемонстрировала высокую степень регенерации, восстановления волосяного покрова, уменьшения площади рубца по нормотрофическому типу, что позволит рассматривать данные растворы как перспективные для лечения сельскохозяйственных животных.