Определение биологически активных веществ в водно-спиртовых экстрактах из листьев облепихи и смородины

Облепиха крушиновидная ( Hippophae rhamnoides L.) из семейства лоховых ( Elaeagnaceae ) - уникальное по составу растение с большим содержанием многих биологически активных веществ. Листья облепихи обладают ярко выраженным противовирусным, ранозаживляющим, противовоспалительным, гепатопротекторным, иммуностимулирующим, антиоксидантным и противоопухолевым эффектом [1]. По содержанию витамина С практически не уступают ягодам, поэтому их с успехом используют для приготовления витаминных чаев, включают в состав травяных сборов для профилактики и лечения авитаминоза. Листья облепихи накапливают дубильные вещества, которые являются действующим началом лекарственного средства - гипорамина, обладающего противовирусной активностью. Кроме того, они содержат соли Sc, Ti, V, Cr [2], кверцетин-3-галактозид, 1-ферулойил-β-D-глюкопиранозид, изорамнетин-3-O-глюкозид, кверцетин 3-O-β-D-глюкопиранозид, кверцетин 3-O-β-D-глюко-пираносил-7-O-α-L-рамнопиранозид, изорамнетин-3-O-рутинозид, кемпферол, изорамнетин [3]. В листьях облепихи определены катехины и токоферолы [4], флавоновые гликозиды ги-пофазеозиды [5].

Благодаря целебному составу листья облепихи эффективны при простуде, заболеваниях горла, органов дыхания. Листья снимают физическое и психическое напряжение, стабилизируют давление, используются как вспомогательное средство при лечении болезней сердца за счет укрепления стенок сосудов. Ванны с отваром листьев показаны при заболеваниях суставов и опорно-двигательного аппарата. Наружно можно применять при экземах, дерматитах и других проблемах с кожей. Также они способствуют улучшению зрения, оздоравливают ротовую полость, помогают бороться с последствиями радиационного облучения [1, 4].

Исследование Н.A. Васильевой с коллегами из ФГБНУ «Бурятский научно-исследовательский институт сельского хозяйства» (г. Улан-Удэ) биохимического состава бурятских сортов облепихи показало, что условия экстремального климата Республики Бурятия способствуют более повышенному содержанию витаминов, полифенольных соединений, сахаров, кислот, сухих веществ в исследуемых образцах [6].

В исследованиях новосибирского ученого Г.M. Скуридина с коллегами проб листьев четырех Алтайских популяций Западной России, методом РФА-СИ установлено, что в 10 г сухого вещества содержится около 70 % суточной нормы Mn, до 20 % Fe и Са и до 40 % Сr [6]. Также ученые отметили, что в листьях облепихи не накапливаются токсичные элементы (Pb и Аs) [7].

Э.Н. Новрузовым совместно с учеными Института ботаники был изучен флавоноидный состав листьев мужских экземпляров облепихи Азербайджана спектрофотометрическим методом, который показал, что содержание флавоноидов составило 2,81 - 3,2 % [8]. Флавоноиды обладают антиоксидантными свойствами и могут модулировать активность ферментов (циклооксигеназы, фосфолипазы А2, глютатионредуктазы и др., что вносит вклад в сосудорасширяющее, антиканцерогенное и иммуномодулируещее действие.

Таким образом, листья облепихи можно рассматривать как перспективный источник БАВ, так как все части растения содержат широкий комплекс биологически активных и питательных веществ. При этом они являются крупнотоннажным отходом переработки плодов и применяются в настоящее время в основном в качестве витаминной добавки в корм сельскохозяйственных животных.

Еще одним из перспективных растительных объектов для комплексной переработки являются листья смородины черной (Ribes nigrum L.), представителя семейства крыжовниковых. На основе исследований многих ученых обнаружено, что листья смородины содержат витамины, флавоноиды, дубильные вещества, органические кислоты, эфирное масло, минеральные соли. Максимальное количество витамина С в листьях данного растения накапливается к концу вегетативного периода, при этом его количество в 1,2-2,3 раза больше, чем в ягодах, что обусловлено низким содержанием в листьях ферментов, разрушающих его. Содержание витамина С в 100 г растительного сырья превышает физиологическую норму суточной потребности человека (90 мг/сут).

По количественному содержанию в листьях черной смородины превалируют флавоны, среди которых преобладают конденсированные катехины (катехин и эпикатехин). Содержание их в листьях в 10 - 25 раз больше, чем в ягодах. Среди флавонолов, содержащихся в листьях, преобладают гликозиды изокверцетина, за ними следуют гликозиды кемпферола и мирицетин. В 100 г свежих листьев смородины может содержаться до 980 - 2700 мг флавонолов, 574 - 3320 мг катехинов, 504 - 1320 мг лейкоантоцианов и других БАВ [9, 10]. Усиление образования антоцианов в клетках растений происходит при снижении температур окружающей среды, при остановках синтеза хлорофилла. Поэтому больше всего их накапливают растения в местностях с суровыми климатическими условиями

Основным классом биологически активных соединений листьев черной смородины являются флавоноиды. Флавоноиды используются для контроля качества сырья для качественного и количественного определения. Листья содержат гликозиды кверцетина, кемпферола, мирицетина, и изорамнетина [10]. Листья содержат несколько групп полифенольных соединений, в том числе проантоцианидины и цианидины. Найдены катехин, эпикатехин, галлокате-хин, эпигаллокатехин, галлокатехин -(4а->8)-галлокатехин, галлокатехин -(4а->8) эпигаллока-техин, галлокатехин-(4а->8)-катехин, галлокатехин - (4а->6)-галлокатехин, галлокатехин-(4а->8)- галлокатехин -(4а->8)- галлокатехин; дельфинидин-3-О-глюкозид, делфинидин-3-О-ру-тинозид, цианидин-3- О-глюкозид, цианидин-3- О-рутинозид [10 - 12].

При изучении фармакологического действия БАВ черной смородины основным классом для исследования служили полифенольные соединения, которые демонстрировали антиоксидантные, антимикробные и противовирусные свойства [13]. Благодаря этим свойствам полифенольные соединения защищают и поддерживают многие органы и системы, включая систему кровообращения, пищеварительный тракт, нервную систему. Полифенольные соединения, содержащиеся в листьях черной смородины, включая производные кверцетина, обладают противовоспалительным, антимикробным, противовирусным, антитоксическим, антиоксидантным действием и поэтому могут использоваться для лечения рака [14 - 16].

На сегодня актуальной проблемой переработки растительного сырья является обеспечение более полного извлечения всех полезных БАВ и их сохранности. Такие исследования будут способствовать более широкому применению его не только в качестве лекарственного компонента, но и в качестве функционального ингредиента для разработки новых рецептур продуктов здорового питания и напитков.

Целью данной работы явилось определение содержания биологически активных веществ и суммарного содержания антиоксидантов в водно-спиртовых экстрактах из листьев облепихи и смородины в зависимости от условий экстрагирования.

Материалы и методы исследования

Листья черной смородины были собраны в конце фазы плодоношения с экземпляров, выращенных на открытом грунте в климатических условиях Иволгинского района Республики Бурятия. Листья облепихи крушиновидной были собраны в с. Ацула Селенгинского района Бурятии в фазе массового созревания плодов - 3-й фенологической фазе. Образцы листьев смородины и облепихи были высушены при комнатной температуре без доступа солнечного света. Для получения водно-спиртовых экстрактов подготовленный растительный материал был измельчен до размера частиц 2 мм. Как установлено многими исследователями, уровень антиоксидантов и содержание БАВ в извлечениях зависят от температурного режима процесса экстрагирования, аскорбиновая кислота лучше всего извлекаются при температуре 20 °С, а кумарины и флавоноиды - при 80 °С, поэтому для обеспечения большего выхода всех БАВ и обеспечения максимального содержания антиоксидантов в полученных экстрактах была использована дробная мацерация. С целью сохранения аскорбиновой кислоты навеску заливали этиловым спиртом различной концентрации - 40, 50, 60, 70 % в соотношении 1:10, и оставляли на 3, 5, 7, 10 сут при комнатной температуре. Затем экстракт отфильтровывался (вытяжка 1). Шрот повторно заливался спиртом такой же концентрации и экстрагировался на водяной бане при постоянном перемешивании при температуре 80 °С в течение 30 мин. Второе извлечение было также отфильтровано (вытяжка 2). Затем вытяжки 1 и 2 объединяли и в полученных экстрактах листьев облепихи и смородины определяли содержание дубильных веществ в пересчете на танин в соответствии с ОФС.1.5.3.0008.15 [17]. Далее в полученных экстрактах было определено содержание суммарного содержания флавоноидов и суммарного содержания антиоксидантов.

Содержание флавоноидов определяли спектрофотометрическим способом на приборе Cary 300 при Х = 430 нм в кюветах с толщиной слоя 10 мм.

Определение суммарного содержания антиоксидантов проводили амперометрическим методом на установке «Цвет Яуза 01-АА» («Химавтоматика») в пересчете на кверцетин [18].

Экспериментальные исследования и опыты проводили в 5-кpатной повтоpноcти, полученные результаты обрабатывали c помощью программ Statistica и Excel.

Результаты исследований и их обсуждение

Растительное сырье, идущее на приготовление водно-спиртового эктракта, чаще всего не подвергается существенному измельчению, несмотря на известную зависимость степени извлечения БАВ от гранулометрических характеристик сырья. В противном случае в экстракте появляется трудноотделимая мелкодисперсная взвесь, снижающая прозрачность и стойкость готового продукта. Для трав оптимальная степень измельчения составляет 2-10 мм, поэтому листья облепихи и смородины были предварительно измельчены до этого размера.

На первом этапе было исследовано сырье, данные представлены в таблице 1.

Таблица 1

Биологически активные вещества в растительном сырье

Сырье	Содержание флавоноидов в пересчете на кверцетин, %	Содержание дубильных веществ в пересчете на танин, %	Суммарное содержание антиоксидантов в пересчете на кверцетин, (10-3) мг/г
Листья облепихи, d=2,0 мм	31,64±0,02	34,46±1,63	3,52 ± 0,82
Листья смородины, d=2,0 мм	7,72 ± 2,52	11,17 ± 0,06	2,80 ± 0,04

Как показали данные таблицы 1, в листьях облепихи и смородины содержалось достаточное количество БАВ, поэтому необходимо было экспериментальным путем определить необходимые параметры для их наиболее полного извлечения.

Экстракция осуществлялась методом дробной мацерации (настаивание, кипячение) с принудительной циркуляцией экстрагента, позволяющей значительно сократить продолжительность экстракции и повысить выход БАВ в экстракте. Переход веществ из сырья в экстракт идет по схеме: проникновение экстрагента в сырье; смачивание находящихся в клетке веществ; растворение веществ и их смыв из разрушенных клеток и открытых пор; массопере-нос веществ через пористые клеточные мембраны посредством молекулярной диффузии.

Экспериментально установлено, что для большинства видов растительного сырья лучшим экстрагентом является водный раствор этилового спирта с концентрацией от 40 до 70 %, так как при применении именно таких концентраций полученные экстракты обладают более высоким содержанием БАВ. Время мацерации определялось экспериментально, настаивание растительного сырья должно проходить не менее 3 и не более 10 сут.

В ходе предварительных экспериментов были выявлены следующие данные по содержанию дубильных веществ в водно-спиртовых экстрактах из листьев облепихи с концентрациями спирта 40, 50, 60 и 70 % и временем мацерации 3, 5, 7 и 10 сут (табл. 2).

Таблица 2

Содержание дубильных веществ (%) в водно-спиртовых экстрактах из листьев облепихи в зависимости от концентрации этанола и времени экстрагирования

Концентрация этанола, %	Время экстрагирования, сут
	3	5	7	10
40	43,83 ± 0,14	50,64 ± 1,32	65,49 ± 0,35	67,41 ± 0,09
50	62,69 ± 1,77*	63,07 ± 1,22*	68,46 ± 1,23*	54,48 ± 1,04*
60	54,27 ± 2,45	55,30 ± 0,17	56,88 ± 2,78	50,95 ± 0,08
70	47,50 ± 1,03	48,98 ± 0,46	45,49 ± 0,09	44,18 ± 027

- достоверно значимые отличия (р < 0,05).

Повышение концентрации экстрагента вышеприведенных значений не дало увеличения выхода дубильных веществ, поскольку коэффициент диффузии веществ из сырья в раствор при дальнейшем увеличении концентрации спирта снизился. Как полярный растворитель этиловый спирт способствует процессам внутренней и молекулярной диффузии, позволяя достаточно полно извлекать из растительного сырья многие БАВ, проявляющие антиоксидантные свойства, прежде всего - витамины, флавоноиды и фенолокислоты. Как показали результаты, более полно извлекались дубильные вещества из листьев облепихи 50%-ным раствором этилового спирта на 7-е сут мацерации.

Извлечение дубильных веществ из листьев смородины этанолом различных концентраций представлено в таблице 3.

Таблица 3

Содержание дубильных веществ (%) в водно-спиртовых экстрактах из листьев смородины в зависимости от концентрации этанола и времени экстрагирования

Концентрация этанола, %	Время экстрагирования, сут
	3	5	7	10
40	14,03 ± 0,05*	17,89 ± 0,17*	17,18 ± 0,08*	16,83 ± 0,06*
50	10,17 ± 0,12	15,95 ± 0,43	12,81 ± 0,16	13,67 ± 0,72
60	11,95 ± 0,45	12,27 ± 0,38	13,53 ± 0,32	14,73 ± 0,25
70	12,45 ± 0,08	11,92 ± 0,22	13,85 ± 0,42	11,92 ± 0,74

- достоверно значимые отличия (р < 0,05).

Как видно из данных таблицы 3, наибольшее извлечение дубильных веществ происходило на 5-е сут 40%-ным экстрагентом. Подбор концентрации этилового спирта проводили индивидуально для каждого вида растительного сырья.

Также в полученных экстрактах было определено содержание флавоноидов, в пересчете на кверцетин и абсолютно сухое вещество (в %), данные представлены в таблице 4.

Сумма флавоноидов в водно-спиртовых экстрактах из листьев облепихи, %

Таблица 4

Концентрация этанола, %	Время экстрагирования, сут
	3	5	7	10
40	54,46 ± 0,20*	42,58 ± 0,69*	41,85 ± 0,13*	36,83 ± 0,09*
50	20,60 ± 0,14	33,86 ± 0,20	20,26 ± 0,48	19,67 ± 0,18
60	19,36 ± 0,28	25,47 ± 0,35	14,21 ± 0,07	13,73 ± 0,21
70	37,84 ± 0,07	20,60 ± 0,09	20,19 ± 0,14	19,92 ± 0,12

- достоверно значимые отличия (р < 0,05).

Из данных таблицы 4 видно, что наибольший выход флавоноидов из листьев облепихи в экстракт происходил на 3-и сут 40%-ным раствором спирта.

В таблице 5 представлено содержание флавоноидов в водно-спиртовых экстрактах из листьев смородины с концентрациями спирта 40, 50, 60 и 70 %.

Таблица 5

Сумма флавоноидов в водно-спиртовых экстрактах из листьев смородины, %

Концентрация этанола, %	Время экстрагирования, сут
	3	5	7	10
40	40,13 ± 0,12	39,65 ± 0,08	35,31 ± 0,13	31,23 ± 1,12
50	30,62 ± 0,09	28,06 ± 0,56	27,31 ± 0,43	27,67 ± 0,73
60	36,15 ± 0,23	20,55 ± 0,14	18,21 ± 0,32	16,73 ± 0,15
70	61,51 ± 0,56*	41,17 ± 0,27*	38,19 ± 0,19*	29,92 ± 0,21*
* - достоверно значимые отличия (р < 0,05).

Максимальное содержание флавоноидов в экстрактах наблюдалось на 3-и сут с концентрацией спирта 70 %. С увеличением времени экстрагирования содержание флавоноидов уменьшалось в течение 10 сут как у листьев облепихи, так и у листьев смородины.

Данные по суммарному содержанию антиоксидантов в листьях облепихи и смородины представлены в таблицах 6, 7.

Таблица 6

Суммарное содержание антиоксидантов в водно-спиртовых экстрактах из листьев облепихи, мг/г

Концентрация этанола, %	Время экстрагирования, сут
	3	5	7	10
40	9,78 ± 0,18	18,33 ± 1,09	11,80 ± 0,33	9,24 ± 0,09
50	9,42 ± 0,29	18,49 ± 0,15	16,42 ± 0,48	14,21 ± 0,18
60	13,05 ± 0,32	19,26 ± 0,18*	14,82 ± 0,07	14,73 ± 0,21
70	9,43 ± 0,67	17,88 ± 0,22	13,72 ± 0,14	12,93 ± 0,12
* - достоверно значимые отличия (р < 0,05).

Из представленных данных наблюдаем наибольший выход ССА 60%-ным экстрагентом на 5-е сут.

Таблица 7

Суммарное содержание антиоксидантов в водно-спиртовых экстрактах из листьев смородины, мг/г

Концентрация этанола, %	Время экстрагирования, сут
	3	5	7	10
40	11,75 ± 0,26	29,43 ± 0,33	19,30 ± 0,34	16,68 ± 0,82
50	13,81 ± 0,32	32,76 ± 0,25*	19,51 ± 1,01	18,58 ± 0,24
60	13,41 ± 0,54	30,29 ± 0,19	18,05 ± 0,09	13,76 ± 0,12
70	10,13 ± 0,08	15,16 ± 0,21	14,56 ± 0,11	13,38 ± 0,65

^* - достоверно значимые отличия (р < 0,05).

Из таблицы 7 видно, что наибольшее CCA наблюдалось у 50%-ного экстракта на 5е сутки экстрагирования.

Исходя из вышесказанного, при получении спиртованных экстрактов следует подбирать оптимальные параметры экстрагирования отдельно для каждого вида сырья.

Заключение

В ходе проведенных экспериментов установлено, что для различных видов растений необходим индивидуальный подбор условий водно-спиртового экстрагирования с целью извлечения того или иного БАВ в большем количестве. Так, 50%-ным раствором более полно извлекаются дубильные вещества из листьев облепихи на 7-е сут мацерации, наибольший выход флавоноидов листьев облепихи в экстракт происходит на 3-и сут 40%-ным раствором спирта, наибольший выход ССА происходит при обработке 60%-ным экстрагентом на 5-е сут. Наибольшее извлечение дубильных веществ листьев смородины происходит на 5-е сут 40%-ным экстрагентом, максимальное содержание флавоноидов наблюдается на 3-и сут с концентрацией спирта 70 %, наибольшее CCA наблюдается при применении 50%-ного экстракта на 5-е сут мацерации.

Поскольку подбор концентраций экстрагента и времени мацерации не дал однозначных данных, на следующем этапе исследований будет предложено использование более совершенных технических решений, таких как ультрузвуковая экстракция и сверхкритическая экстракция углекислым газом [19].