Определение хронической токсичности пробиотика Bacillus coagulans

Бактериальные инфекции животных и птиц по-прежнему являются серьёзной проблемой современного животноводства, нанося колоссальный экономический ущерб и играя ведущую роль в возникновении болезней человека, в том числе пищевых отравлений [4, 10]. В настоящее время молочнокислые, пропионовокислые и бифидобактерии находят более широкое применение в животноводстве и птицеводстве для нормализации микрофлоры желудочнокишечного тракта, формировании микробных биоценозов [1, 12].

Для повышения приростов молодняка сельскохозяйственных животных и птицы, профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний применяют как лекарственные средства, так и пробиотические препараты, биологически активные добавки на основе живой микрофлоры [6-8, 11]. В последнее время, в рамках импортозамещения разрабатываются новые отечественные пробиотические препараты, которые требуют детального изучения перед внедрением их в производство. Хотя большая часть бактерий, проявляющих пробиотические свойства относятся к семейству Lactobacillus и Bifidobacterium, одним из наиболее перспективных пробиотических микроорганизмов является спорообразующая лактобактерия Bacillus coagulans. В форме спор она хорошо переносит технологические процессы и хранение, не разрушается под влиянием желудочного сока и желчи.

Попадая в двенадцатиперстную кишку, споры Bacillus coagulans могут прорастать в вегетирующие бактерии в просвете кишечника животного и оказывать свои пробиотические эффекты. Вытесняя из кишечного тракта патогенную микрофлору, они не влияют на представителей естественного биоценоза, способствуют нормализации процессов пищеварения и перевариванию комбикормов [4, 13]. Важным является также вопрос дозы и кратности приема пробиотических препаратов. При назначении пробиотиков необходимо указывать рекомендованную дозу, эффективность которой доказана в клинических исследованиях [3, 9].

Целью наших исследований явилось определение доз и изучение токсикологического действия пробиотического препарата Bacillus coagulans на лабораторных животных. Определение хронической токсичности позволит показать степень повреждающего действия, изучаемого пробиотика или его отсутствия при его длительном применении, выявить наиболее чувствительные органы и системы организма. Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

• -    определить дозы и кратность приема пробиотического препарата Bacillus coagulans;

• -    изучить влияние пробиотика на некоторые биохимические показатели лабораторных мышей при его длительном применении.

Материал и методы исследований. Научно-исследовательская работа проводилась в виварии на кафедре хирургии, акушерства, фармакологии и терапии УлГАУ. Биохимический анализ крови проводили по современным методикам в межкафедральном центре факультета ветеринарной медицины и биотехнологии УлГАУ, используя анализатор «Stat Fax 1904 Plus».

Объектами научного исследования стали б/п белые мыши (80), которых сформировали в четыре группы (3 опытных и 1 контрольная) по 20 животных. Средняя живая масса одной мыши составила 32,1 г. Все животные содержались в виварии в стандартных клетках при 12-часовом световом режиме, имели свободный доступ к пище и воде (в соответствии со стандартами, утвержденными МЗ РФ). С учётом того, что при изучении острой токсичности пробиотика не смогли установить ЛД50, было определено 3 дозы, которые соответствовали минимальному и максимальному объему желудка животных, и подобрана промежуточная доза.

В ходе опыта пробиотик Bacillus coagulans давали энтерально 1 раз в день каждому животному на голодный желудок в течение 30 дней. Для точного дозирования высушенные кусочки хлеба пропитывали пробиотиком в установленных дозах (Таблица 1).

Таблица 1 – Схема опыта и результаты испытаний

Группа	Вид животно го	Количество исследуемого препарата	Результат испытаний, гол
			заболело	пало	выжило
1-группа (контроль)	мыши	0,5 мл дистиллированной воды	-	-	20
2-группа (опыт)	мыши	0,5 мл 107 КОЕ пробиотика	-	-	20
3-группа (опыт)	мыши	0,6 мл 107 КОЕ пробиотика	-	-	20
4-группа (опыт)	мыши	0,7 мл 107 КОЕ пробиотика	взъерошенность шерстного покрова	-	20

Наблюдения за животными вели постоянно, в течение всего периода скармливания препарата: фиксировали общее состояние, поведение и активность животных, состояние их слизистых оболочек, окраску и взъерошенность шерсти, характер стула, вели учёт массы тела контрольным взвешиванием. После окончанию опыта проводили убой животных хлороформным наркозом, осуществляли вскрытие и осмотр внутренних органов. Для исследований отбирали пробы печени и крови. Результаты обрабатывали по программе "Statistika".

Результат исследований. В ходе исследований, при наблюдении за животными в 1-й, 2-й и 3-й группе были установлены сходные результаты по контролируемым показателям (состояние шерсти, активность, слизистые, стул), которые в течение всего опыта оставались без изменений. Все животные были клинически здоровыми и хорошо прибавляли в массе. Однако мыши 4-й группы в целом имели сходные параметры, но в отличие от животных других групп, их шерстный покров после 15-й дачи пробиотика и до конца опыта был взъерошенным. Более детальная характеристика состояния лабораторных животных была отмечена при изучении биохимического состава их крови белых (Таблица 2, Рисунок 1).

С целью тестирования степени повреждающего действия пробиотика Bacillus coagulans было проведено исследование содержания глюкозы в крови как чувствительного показателя, сигнализирующего о деструктивных процессах в тканях поджелудочной железы, о стрессовом состоянии организма, поражении печени.

Результаты опыта позволили установить, что в контрольной группе содержание глюкозы в сыворотке крови мышей варьировало в рамках 3,1± 0,17 ммоль/л. Во всех остальных группах уровень глюкозы повышался в пределах физиологической нормы. Скармливание животным Bacillus coagulans способствовало увеличению концентрации в их крови глюкозы при дозировке 0,5 мл 107 КОЕ – до 3,8±0,38 ммоль/л (на 22,5 %); при 0,6 мл 107 КОЕ – до 3,5±0,26 ммоль/л (12 %); при 0,7 мл 107 КОЕ – до 4,01±0,5 ммоль/л (на 29,35 %).

Таблица 2 – Биохимические показатели крови лабораторных мышей при изучении хронической токсичности пробиотика Bacillus coagulans

Показатель	Группы лабораторных животных
	1 группа	2 группа	3 группа	4 группа
АСТ, Е/л	59,9±1,0	101,3±0,1	59,03±2,7	73,9±2,7
АЛТ, Е /л	34,3±4,5	49,3±0,3	32,01±5,9	25,9±2,8
Креатинин, мкмоль/л	68,3±0,3	62,06±0,6	55,6±1,6	49±2,05
Глюкоза, ммоль/л	3,1±0,17	3,8±0,38	3,5±0,26	4,01±0,5
Общий белок, г/л	74,33±0,6	68,58±2,7	53,8±3,3	86,74±1,8

Примечание: при физиологической норме содержания: общего белка – 50…72 г/л, АЛТ – 26,0…89,0 Е/л, АСТ – 59,0…140,0 Е/л, креатинина – 27,0…75,0 мкмоль/л, глюкозы – 2,5…7,0 ммоль/л

Анализ активности ферментов аминотрансфераз: АСТ и АЛТ в сыворотке крови животных опытных по сравнению с контролем показал, что при поступлении в организм мышей 2-й группы 0,5 мл 107 КОЕ пробиотика, активность данных ферментов возросла в 2 и 1,44 раза; применение дозировки

0,6 мл 107 КОЕ для мышей 3-й группы способствовало увеличению данных показателей на 98,54 % и 93,3 %; использовании дозы 0,7 мл 107 КОЕ в 4-й группе повысило активность АСТ на 123,4 % и активность АЛТ на 75,5 % (Рисунок 1).

Рисунок 1  – Показатели активности аминотрансфераз при изучении хронической токсичности

Показатели активности сывороточных ферментов аспартат- и аланинаминотрансферазы были статически недостоверными, значение коэффициента Ритиса в 2-й группе составило 2,0, в 3-й группе – 1,8. У животных 4-й группы этот параметр превысил норму и составил 2,8, что может говорить о нарушениях в функционировании клеток их печени.

Уровень креатинина в 4-й опытной группе заметно снижался и составил 49±2,05 мкмоль/л, что на 28,3 % ниже показателей контрольной группы. Аналогично происходило относительное снижение креатинина в крови животных 2-й (на 9,14 %) и 3-й (на 18,6 %) групп по сравнению с контролем, однако значения были недостоверными и были пределах нормы.

По сравнению с контролем содержание общего белка в сыворотке крови мышей 2-й и 3-й групп находилось в пределах физиологической нормы, а у животных 4-й группы увеличилось на 16,7 %, что было выше физиологической нормы.

Заключение. Определение хронической токсичности пробиотика Bacillus coagulans на лабораторных мышах показало, что при длительном его скармливании в дозировке 0,5 мл 10⁷ КОЕ и 0,6 мл 10⁷ КОЕ не проявляется его токсическое действие на их организм и не оказывает отрицательное влияния на биохимические показатели их крови. Использование же дозы 0,7 мл 10⁷ КОЕ, имеет отрицательный эффект, вызывает взъерошенность шерсти и способствует развитию нарушений в организме лабораторных животных.

Целью работы явилось изучение хронической токсичности нового штамма пробиотика Bacillus coagulans на организм лабораторных животных при длительном его использовании и изучении клинико-биохимических основ. В эксперименте было использовано 80 лабораторных животных (мыши). Лабораторным животным пробиотик Bacillus coagulans давали энтерально 1 раз в день, каждому животному на голодный желудок в течение 30 дней. Гибели лабораторных мышей при использовании пробиотика в изучаемых группах выявлено не было. Для выявления повреждающего действия были изучены биохимические показатели: АСТ, АЛТ, глюкоза, общий белок, креатинин. Результаты исследования хронической токсичности пробиотика Bacillus coagulans, свидетельствуют о том, что бактериальная добавка при длительном использовании в дозах 0,5 мл 107 КОЕ – 0,6 мл 107 КОЕ, не проявляет токсического действия на организм.