Оптимизация условий инкапсуляции рутина в клетки дрожжей Saccharomyces cerevisiae

Развитие новых научных знаний в области биохимии, биотехнологии, пищевой технологии и в смежных областях подтверждает гипотезу о том, что питание, помимо своей основной функции, играет важную роль в поддержании здоровья человека и минимизации рисков возникновения неинфекционных заболеваний. На этом принципе основана концепция функционального питания. Компоненты, которые обеспечивают функциональное питание, чаще всего представляют собой витамины, минеральные вещества, ненасыщенные жирные кислоты, про-, пре- и синбиотики, а также минорные биологически активные соединения [1–5].

Минорные биологически активные вещества, среди которых растительные полифенолы, в последнее время привлекают большое внимание как потенциальные пищевые ингредиенты функциональной направленности [1, 5, 7, 15–18]. Класс флавоноидов наиболее богат такими веществами, которые в том числе достаточно хорошо изучены. Среди представителей биологически активных веществ (БАВ) – флавоноидов: рутин, куркумин, кверцетин, дигидрокверцетин и другие.

Клинические исследования, проведенные в отношении флавоноидов показывают, что многие из указанных соединений обладают способностью снижать риск развития рака, диабета, сердечно-сосудистых и других дегенеративных заболеваний. Тем не менее, исследования многих флавоноидов по химиопрофилактике рака in vivo не оправдали ожиданий. Основной причиной является их плохая растворимость во многих растворителях и в воде, биодоступность при пероральном приеме и неспособность пройти барьер в виде жестких воздействий процесса желудочнокишечного переваривания [6, 8–10, 19, 20].

Для обеспечения стабильности биологически активных соединений или улучшения их технологической пригодности для пищевых производств, а также увеличения биодоступности для организма человека требуется разработка новых решений. В качестве такого решения может выступать инкапсуляция – процесс, при котором БАВ защищаются материалом носителя при образовании капсул в микрометровом или нанометровом масштабе [3, 5, 8, 11, 17, 19].

Одним из экономически доступных видов инкапсуляции БАВ можно рассматривать использование в качестве защитной капсулы дрожжевой клетки, в частности Saccharomyces cerevisiae .

Клеточная стенка дрожжей состоит из внутреннего слоя несущих полисахаридов, выступающих в качестве каркаса и защитного наружного слоя маннопротеинов. Основным полисахаридом, несущим нагрузку, является разветвленный 1,3-β-глюкан. Благодаря наличию боковых цепей молекулы 1,3-β-глюкана и гибкой спиралевидной форме, отдельные молекулы β-глюкана могут связываться только локально через водородные связи, что приводит к образованию трехмерной сети, очень эластичной и способной пропускать молекулы разного размерного ряда. Полисахариды клеточной стенки дрожжей функционируют как каркас для внешнего слоя гликопротеинов. В совокупности эти гликопротеины ограничивают проницаемость клеточной стенки для макромолекул, и наоборот, они способны пропускать малые молекулы. Плазматическая же мембрана клеточной стенки дрожжей состоит в основном из липидов и белков примерно в равных пропорциях. Мембранные белки отвечают за регуляцию транспорта растворенных веществ в клетку и из нее, а также препятствуют свободной диффузии растворенных веществ из клетки. Некоторые авторы утверждают, что свойства мембраны клеточной стенки схожи липосомами, что дает осно- вание предполагать возможность инкапсуляции в клетки дрожжей гидрофобных веществ, в том числе флавоноидов [12].

Целью настоящего исследования была оценка влияния температуры и продолжительности процесса инкапсуляции на динамику эффективности загрузки гидрофобного антиоксиданта рутина в живые клетки дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

Материалы и методы

Объекты исследования

В качестве биологически активного соединения был выбран флавоноид рутин (3', 4', 5,7-тетрагидрокси-флавон-3β-D-рутинозид), который представляет собой полифенол, обычно встречающийся в различных растениях, включая цитрусовые плоды, яблоки, помидоры и абрикосы [13].

Рутин, также известный как витамин Р, состоит из агликона кверцетина и дисахарида рутинозы, связанного с кверцетином в положении 3 С-кольца (рис. 1).

Рис. 1. Пространственная структура молекулы рутина [1 313]

На сегодняшний день известно более 130 фармацевтических препаратов, содержащих в своем составе рутин. Среди установленных фармакобиологических свойств рутина можно выделить антиоксидантные, противомикроб-ные, противовоспалительные, антидиабетические, антиадипогенные, нейропротекторные и другие [14, 19, 20].

Условия инкапсуляции

Инкапсуляцию рутина в дрожжевые клетки проводили в водной среде при соотношении компонентов дрожжи:рутин, равной 5:1 по массе. Использовался гидромодуль 1:100.

Инкапсуляцию проводили в термостатируемом встряхивателе при 200 об/мин, в двух температурных режимах 28; 32 и 37 °С в течение 24 часов.

Контроль эффективности инкапсуляции проводили в 3 временных точках, через каждые 8 часов.

Номенклатура показателей и методы анализа

Морфологическая структура образцов рутина была получена с применением просвечивающей электронной микроскопии высокого разрешения (Jeol JEM-2100), увеличение ×5000 .

Количественное содержание рутина определяли при взаимодействии с хлоридом алюминия спектрофотометрически по методике государственной фармакопеи XIV.

Эффективность инкапсуляции (ЭИ) определяли, как отношение БАВ, инкапсулированных, к количеству БАВ, оставшемуся на поверхности клеток дрожжей.

Эффективность инкапсуляции в % рассчитывали по формуле:

Xl-XO

ЭИ (%) = ×100, (1)

где X 1 – общее содержание БАВ (после процедуры разрушения капсул), мг; X 0 – содержание неинкапсулированного БАВ, мг; X 2 – количество БАВ, добавленное при инкапсуляции, мг.

Поиск оптимальных режимов инкапсуляции вели при использовании двухфакторного регрессионного анализа с использованием программного продукта MatCad.

Результаты исследования и их обсуждение

Результаты микроскопии рутина (рис. 2) показывают, что БАВ представляет собой скопление частиц в разном размерном диапазоне, в том числе достаточно крупных кристаллических частиц, склонных к агломерации.

В таблице представлены данные о физико-химических свойствах БАВ, имеющих решающее значение для оценки фармакологического потенциала вещества.

В литературе встречаются противоречивые данные о способности клеток дрожжей сорбировать частицы разного размера. Эластичность β-глюкановой сетки дает возможность предположить способность рутина проникать через нее. Вместе с тем, следующий барьер на пути БАВ – фосфолипидная мембрана – может быть менее проницаема для частиц крупного размера [12, 15].

Рис. 2. Морфология частиц рутина ( ×5000 )

Физико-химические свойства рутина [13]

Свойство	Значение
Растворимость в воде	12,8 г/л
log P	–0,54
Количество акцепторов водорода	21
Количество доноров водорода	13
Количество бензойных колец	6

Многие исследования показывают, что эффективность инкапсуляции биологически активных веществ в клетки дрожжей во многом определяется диффузионными процессами, эффективность которых, в том числе, зависит от растворимости инкапсулируемого вещества [11, 12, 15].

С учетом низкой растворимости рутина, около 1 %, принципиальное влияние может оказать повышение температуры инкапсуляции и увеличение продолжительности самого процесса.

Исследованиями, проведенными ранее, было установлено, что растворимость рутина в воде значительно увеличивается при повышении температуры более 70 °С. И уже через 30– 35 мин значение растворимости рутина превышает указанное в таблице более чем на 40 %.

Вместе с тем, такой температурный диапазон неприемлем для роста и развития дрожжевых клеток. По этой причине в данном исследовании мы осуществляли поиск оптимальных условий инкапсуляции рутина в клетки дрожжей Saccharomyces cerevisiae, используя двухфакторный регрессионный анализ.

Оценка динамики процесса инкапсуляции рутина в дрожжи Saccharomyces cerevisiae представлена на рис. 3. Полученные данные свидетельствуют о значительной вариабельности процесса инкапсуляции рутина в клетки дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Установлено, что на эффективность инкапсуляции оказывают влияние оба оцениваемых фактора: температура и продолжительность процесса инкапсуляции.

Весомый вклад в повышение эффективности инкапсуляции внес временной фактор. Наблюдается четкая положительная зависимость роста эффективности инкапсуляции от продолжительности ведения процесса.

Так, через 24 часа значения эффективности инкапсуляции увеличивается по отношению к значениям в 8 часовой отметке, не зависимо от температуры. Положительное влияние продолжительности процесса инкапсуляции на его эффективность являлось ожидаемым и согласуется с данными, представленными в литературе. Определяется это, вероятно, вкладом двух факторов: постепенным увеличением доли растворенного рутина и ростом биомассы дрожжей, способных инкапсулировать биологически активные вещества.

Вместе с тем, было установлено, что в промежуток 8–16 ч процесс инкапсуляции протекал с более высокой эффективностью, чем во второй период (16–24 ч). (удалила)

Биосорбция органических веществ клетками дрожжей может быть представлена следующими стадиями: миграция органических соединений из жидкого раствора в пограничный слой частиц дрожжей; поверхностная диффузия внутрь клеток дрожжей; диффузии в поры биомассы; биосорбция активных центров внутри клеток [11]. Вероятно, каждый из этих этапов характеризуется собственными значениями удельной скорости и эффективности инкапсуляции, что требует дальнейшего изучения.

Положительное влияние повышения температуры на процесс инкапсуляции было отмечено в период 8–16 ч. Однако во второй временной отрезок эффективность инкапсуляции рутина при температуре 37 °С снижается в сравнении с температурным режимом 32 °С. Объяснением данному факту может быть то, что оптимальным температурным режимом для роста дрожжей Saccharomyces cerevisiae является диапазон 30–32 °С. Согласно литературным данным кратковременное увеличение температуры до сверхоптимальных значений (37–40 °С) может стимулировать рост дрожжевой массы, при этом длительное воздействие таких температур угнетает жизнедеятельность дрожжей.

Рис. 3. Динамика процесса инкапсуляции образцов рутина в клетки дрожжей

Проведение процедуры оптимизации позволило установить оптимальное сочетание двух факторов: температуры и продолжительности процесса инкапсуляции. Установлено, что наиболее высокие значения эффективности инкапсуляции рутина в клетки дрожжей Saccharomyces cerevisiae достигаются при 23,7 часа и 33,8 °С (рис. 4).

Рис. 4. Зависимость эффективности инкапсуляции рутина от температуры и продолжительности процесса

С учетом физического смысла величин в качестве рационального режима был принят режим инкапсуляции: температура 33 °С и длительность процесса 24 часа. Установлен- ный режим инкапсуляции был отработан, фактическая эффективность инкапсуляции составила 64,8 %.

Заключение

Таким образом, проведенные исследования подтвердили возможность инкапсуляции рутина в живые клетки дрожжей Saccharo-myces cerevisiae методом простой диффузии. Вместе с тем, эффективность инкапсуляции рутина, даже при значительных временных затратах, не достигала 65 %. Такие результаты могут объясняться низкой растворимостью флавоноида в воде, его склонностью к полимеризации и агломерации частиц.

Вместе с тем, для увеличения загрузки БАВ в клетки дрожжей целесообразно варьировать и временной режим процесса.

В качестве перспективного подхода для повышения эффективности инкапсуляции рутина в клетки дрожжей может также рассматриваться предварительное микроструктурирование БАВ.

Кроме того, следует оценить влияние соотношения БАВ:дрожжи на эффективность процесса инкапсуляции, а также более глубоко оценить термодинамические закономерности процесса инкапсуляции минорных биологически активных веществ полифенольной природы в клетки дрожжей Saccharomyces cerevisiae . Все это составляет основу будущих исследований.