Острая токсичность яда восточной степной гадюки для сверчков: некоторые результаты, имеющие методическое значение

Важной составляющей пищевого рациона восточной степной гадюки (гадюки Ренара) Vipera renardi , являются прямокрылые насекомые (отряд Orthoptera) [1, 3, 4, 9]. Доля прямокрылых в рационе змей данного вида велика летом и осенью [2, 10].

Для нескольких видов гадюк подрода Pelias была установлена взаимосвязь токсичности ядовитого секрета гадюк с энтомофагией – чем выше процент насекомых в рационе данного вида гадюк, тем токсичнее для банановых сверчков ядовитый секрет [11]. Эти результаты подтверждаются и нашими данными по токсикометрии ядов гадюк Волжского бассейна на сверчках: яд восточной степной гадюки имеет более низкие значения ЛД₅₀ по сравнению с обыкновенной гадюкой [7]. По нашим данным, яд новорожденных гадюк Ренара отличается от яда взрослых особей более высокой токсичностью по отношению к домовым сверчкам [8].

В вышеупомянутых и других доступных публикациях не отмечен ряд методических особенностей при токсикометрии ядов гадюк на насекомых, в частности, сезонная специфичность воздействия ядовитого секрета на прямокрылых, различия в чувствительности самцов и самок сверчков к яду, а также различия в значениях ЛД50, полученных в экспериментах на разных видах насекомых.

Цель настоящей статьи – проанализировать некоторые результаты определения ЛД50 яда гадюк на сверчках, которые необходимо учитывать при планировании и проведении токсикометрических экспериментов.

МАТЕРИАЛЫИ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Экспериментальные животные. Исследования токсичности яда V. renardi проводили на культурах домовых Acheta domesticus и банановых Gryllus assimilis сверчков, которых разводили и выращивали в лаборатории в сухом термостатируемом помещении при температуре 26-28ºС и относительной влажности 25-35%. Условия содержания и разведения были примерно одинаковые, с теми отличиями, что культура банановых сверчков требует более высокой температуры и влажности, которые регулировали мощностью точечного источника тепла внутри контейнера и размерами поилки.

Сверчков содержали и разводили в пластиковых контейнерах 60×40×40 см. Кормом служили сухая смесь (молотые овсяные хлопья, сухое молоко, сухой гаммарус) и свежие овощи (морковь, салат). Один раз в неделю в корм сверчкам добавляли мелкорубленое вареное яйцо. В качестве поилки использовали пластиковую чашку Петри с губкой, смоченной водой.

В работе использовали сверчков обоих видов на стадии предимаго: для домовых сверчков формировали группы массой 0,30-0,40 г, для банановых – 0,50-0,59, 0,60-0,69 и 0,70-0,79 г. Для расчета эффективных доз яда применяли среднюю массу сверчков в группе.

Ядовитый секрет гадюк. В экспериментах использовали образцы ядовитого секрета номинативного подвида гадюк Ренара V. r. renardi , отловленных в мае 2013 г. в окрестностях с. Верхняя

Добринка Камышинского района Волгоградской области. Отбор ядовитого секрета у гадюк проводили в лаборатории механическим способом, массируя пальцами ядовитые железы. Выбор этих образцов обусловлен тем, что из данной выборки гадюк было получено 20 индивидуальных образцов ядовитого секрета, и яда было достаточно для проведения не только биохимических анализов, но и токсинологических экспериментов по определению ЛД50 [8]. После ядоотбора гадюки были выпущены в места отлова.

Токсикометрия. Для определения ЛД₅₀ ядов гадюк использовали свежеприготовленные водные растворы яда в концентрации 2,0 мг/мл. Инъекции растворов ядов насекомым проводили микрошприцом (объем 1-30 мкл) внутрибрюшинно: домовым сверчкам раствор яда вводили в нижнюю половину брюшка с дорзальной стороны, банановым – в правую нижнюю четверть брюшка. Эти различия в местах инъекций обусловлены исключительно физическими размерами этих насекомых. Для определения значения ЛД₅₀ одного образца яда использовали 25-35 сверчков одной весовой группы: 5-7 эффективных доз по 5 сверчков в каждой. При определении ЛД₅₀ ядовитого секрета проверяли диапазон доз от 2,0 до 60,0 мкг/г. В день проведения острого опыта сверчков не кормили и убирали поилку. Контейнеры со сверчками после инъекций яда инкубировали также при температуре 26,0-28,0ºС в течение 24 часов, после чего острый опыт прекращали, фиксируя количество мертвых и выживших насекомых. Значения ЛД₅₀ рассчитывали методом модифицированного пробит-анализа [5, 6]. Определение среднесмертельной дозы одного образца яда проводили не менее чем в двух независимых экспериментах, и ниже в статье приведены средние по результатам двух экспериментов значения ЛД₅₀.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Сезонные изменения устойчивости сверчков к действию яда. При определении токсичности индивидуальных образцов яда ренаровых гадюк было отмечено, что на разных поколениях домовых сверчков Acheta domesticus для одних и тех же индивидуальных образцов ядовитого секрета значения среднесмертельных доз ЛД50 отличались (табл. 1, рисунок). Снижение абсолютных значений ЛД50 с июля 2013 г. по январь 2014 г. может быть вызвано разными причинами – либо происходит «вырождение» культуры сверчков из-за близкородственного скрещивания, либо у сверчков в течение сезона меняется устойчивость к яду. Для уточнения причин мы продолжили наши наблюдения и определили ЛД50 тех же образцов яда на следующих генерациях сверчков, выведенных весной и летом 2014 г.

В данной серии экспериментов лимитирующим фактором было наличие сверчков в некоторых генерациях, чем и определялось разное количество проанализированных образцов. Половозрелых сверчков из каждого поколения использовали в качестве производителей для выведения последующего поколения. Здесь же необходимо уточнить, что в табл. 1 и на рисунке указаны месяцы, когда проводили эксперименты со сверчками, а не сроки их выведения. В опытах использовали сверчков возрастом примерно в 1,5 месяца. Таким образом, мы проанализировали 6 поколений сверчков, полученных в 2013-2014 гг.

В разные сезоны 2013-2014 гг. реакция сверчков на одни и те же образцы яда оказалась различной. Минимальные значения ЛД50 отмечены в 2014 г. у «зимнего» поколения домовых сверчков, а определенные летом 2014 г. (июнь и август) значения ЛД50 яда практически вернулись к прежним, отмеченным летом и осенью 2013 г. Это позволило нам исключить предположение о возможном вырождении лабораторной культуры сверчков из-за длительного близкородственного скрещивания.

Полученные результаты говорят, скорее всего, о том, что домовые сверчки по-разному реагируют на яд гадюк в разное время года, что необходимо учитывать при проведении токсинологических экспериментов на этом виде насекомых. Вполне вероятно, изменение устойчивости к яду объясняется сезонными перестройками в метаболизме сверчков.

При работе с культурой другого вида сверчков – банановых Gryllus assimilis – направленных сезонных отличий нами обнаружено не было. На имеющихся данных, полученных при воздействии одного и того же образца яда на насекомых разных поколений, не выявлены статистически

Таблица 1. ЛД₅₀ образцов яда восточной степной гадюки для домовых сверчков

ЛД 50 , мкг/г	Время определения ЛД 50
	Июль 2013 г.	Октябрь 2013 г.	Январь 2014 г.	Март 2014 г.	Июнь 2014 г.	Август 2014 г.
min	10,2±2,88	10,7±3,04	1,7±0,47	6,3±1,77	10,1±2,89	17,1±4,84
max	51,3±10,16	37,5±6,67	14,2±4,01	27,6±7,81	26,8±3,24	23,4±6,63
средние	24,7±2,02	21,0±2,42	6,6±0,79	11,2±1,29	16,9±1,20	20,7±0,63
n	20	12	20	17	16	9

Примечание: n – количество определений ЛД₅₀ в 20 индивидуальных образцах ядовитого секрета.

Рис. Значения ЛД₅₀, полученные на разных поколениях домовых сверчков (июль 2013 г. – август 2014 г.)

значимые различия в их устойчивости к яду. Так, значения ЛД50 одного и того же образца яда восточной степной гадюки оказались следующими: 22,5±3,51 мкг/г (дата эксперимента 21.11.2014 г.) и 22,7±4,56 мкг/г (дата эксперимента 12.05.2015 г.).

Видоспецифичность действия ядовитого секрета на сверчков. Целью данной серии экспериментов было сравнение устойчивости разных видов сверчков к яду V. renardi. Для этого мы определили значения ЛД₅₀ одного и того же образца яда на двух видах сверчков (домовых Acheta domesticus и банановых Gryllus assimilis ), масса которых у обоих видов была одинаковая (0,30-0,39 г). Как видно из данных табл. 2, разница в значениях ЛД₅₀ является статистически незначимой, что говорит в пользу отсутствия видоспецифичности воздействия яда Ренаро-вых гадюк на эти виды сверчков. При этом мы не исключаем такой возможности, что на других видах прямокрылых, используемых гадюками в качестве объектов питания, могут быть получены иные значения среднесмертельных доз.

Половые различия в устойчивости сверчков к яду гадюк. В этой серии экспериментов мы провели определение величины ЛД50 яда гадюк Ренара на разнополых банановых сверчках мас- сой 0,70-0,79 г. При такой массе сверчки уже легко дифференцировались по полу – самки от самцов отличались наличием выраженного яйцеклада. Как видно из данных табл. 3, для одного и того же образца яда на выборках самцов и самок сверчков были получены одинаковые значения ЛД50, т.е. в наших экспериментальных условиях половые различия в реакции насекомых на яд гадюк не были обнаружены. Этот вывод имел практическое значение и позволил в дальнейшем проводить токсикометрию на выборках сверчков, включающих как самцов, так и самок.

Проведенные эксперименты по определению ЛД50 яда гадюк Ренара на сверчках позволяют сделать следующие обобщения, имеющие методическое значение при проведении токсикометрических исследований на насекомых. Во-первых, разные поколения домовых сверчков, полученные в течение года, по-разному реагируют на яд гадюк, снижая устойчивость к нему в зимнее время. Во-вторых, отмечено отсутствие статистически значимых различий в реакции двух видов сверчков на яд гадюк. В-третьих, между значениями ЛД50, полученными на самцах и самках банановых сверчков, не выявлено статистически значимых различий.

Таблица 2 . Видоспецифичность действия яда гадюк на разные виды сверчков

Вид сверчков	ЛД 50 , мкг/г	tф	P
домовые Acheta domesticus	20,1±3,19	0,544	>0,05
банановые Gryllus assimilis	22,4±2,80

Примечание: в опыте использовали 7 групп сверчков по 5 шт. в каждой; проанализировали следующие дозы яда – 2,0; 5,0; 10,0; 20,0; 30,0; 40,0; 50,0 мкг/г.

Таблица 3 . Значения ЛД₅₀ яда гадюк, полученные на самцах и самках банановых сверчков

пол сверчков	ЛД 50 , мкг/г	tф	P
самцы	21,4±1,98	0,108	>0,05
самки	21,0±3,01

Примечание: в опыте использовали 5 групп насекомых по 5 шт. в каждой; проанализировали следующие дозы яда – 2,0; 5,0; 10,0; 20,0; 40,0 мкг/г.