Передача гена устойчивости к трибенурон-метилу в селекционный материал подсолнечника ВНИИМК

Поиск наследственной устойчивости к гербицидам в популяциях культурных растений и их дикорастущих сородичей привлекает внимание учёных как с точки зрения познания генетики этого признака, так и с целью разработки инновационных агротехнологий.

В настоящее время используется производственная система возделывания подсолнечника, имеющая несколько названий – ExpressSun, Экспресс или СУМО, представляющая собой комбинацию гербицида, являющегося ALS-ингибитором из группы сульфонилмочевин, и генотипов подсолнечника, устойчивых к этому гербициду [1].

Создание гербицидоустойчивых гибридов подсолнечника стало возможным после обнаружения в дикорастущих популяциях резистентных особей к трибе-нурон-метилу – веществу из группы сульфонилмочевиновых гербицидов. Так, 57 % из 46 природных популяций Helian-thus annuus L. и трех популяций H. petio-laris Nutt., семена которых были собраны в ходе экспедиций в пяти штатах США в 2002 г., обладали устойчивыми к трибе-нурон-метилу особями [2]. При этом в южных регионах, где сульфонилмочеви-ны использовались более длительное время, доля популяций с устойчивыми растениями была выше, например, в штате Канзас до 94 %.

Аналогичные результаты были получены также при изучении популяционной структуры 23 образцов дикораcтущего H. annuus из коллекции, собранной в трех провинциях Канады в 1994 г. и хранящихся в генбанке. Так, 52 % популяций обладали устойчивыми особями, причём доля устойчивых к трибенурону растений в этих популяциях в среднем составляла 3 % с максимальным лимитом до 6 % [3]. Однако шесть популяций H. petiolaris из двух провинций Канады не показали гер-бицидоустойчивости. Очевидно, что резистентные к трибенурону дикорастущие растения подсолнечника существовали в природе до появления производственной системы ExpressSun.

Интродукция гена устойчивости к три-бенурон-метилу от дикорастущего H. an-nuus из Канзаса в генофонд культурного подсолнечника завершилась созданием двух публичных источников этого признака [4]. SURES-1 представляет собой инбредную линию закрепитель стерильности, полученную после скрещиваний HA424/3/HA406//HA89/SU Res. wild H. annuus , а SURES-2 является линией восстановителем фертильности на основе скрещиваний RHA377/3/RHA392// RHA376/ SU Res. wild H. annuus.

С молекулярно-генетической точки зрения устойчивость к сульфонилмочеви-нам у линий SURES представляет собой точковую мутацию в гене фермента AHAS (ALS), а именно замену С-Т в кодоне 197 [5]. Эта транзиция приводит к моноаминокислотному изменению про-лин-лейцин в первичной структуре фермента, что модифицирует его конформацию и делает устойчивым к действию гербицида. С другой стороны, данных об изучении наследования признака с проведением гибридологического анализа в литературе не содержится [6].

Кроме источника SURES, устойчивость к трибенурону описана также у линии HA89 после химического мутагенеза c применением EMS. Именно последний генетический источник использован в запатентованной технологии ExpressSun [6].

В лаборатории генетики ВНИИМК работа по изучению линий SURES-1 и SURES-2 ведётся с 2005 г. В частности, доказан негативный эффект сульфонил-мочевинового гербицида Гранстар на развитие клубеньков вирулентной популяции заразихи из Ростовской области при оценке в условиях теплицы [7].

Целью нашей работы было селекционно-генетическое изучение признака устойчивости к сульфонилмочевиновым гербицидам у подсолнечника. Для этого предполагалось оценить коллекцию линий ВНИИМК по устойчивости к трибе-нурон-метилу, изучить наследование этого признака, а также создать доноры и аналоги селекционных линий ВНИИМК с устойчивостью к трибенурон-метилу.

Материал и методы. Исследования проведены в 2005–2012 гг. на центральной экспериментальной базе ВНИИМК, включая полевые опыты и выращивание растений в камерах фитотрона. Материалом для работы были: линия-закрепитель стерильности SURES-1 и линия-восстановитель фертильности SURES-2, созданные в США и обладающие, по литературным данным, устойчивостью к трибенурон-метилу; селекционные линии ВНИИМК ВК876, ВК 680, ВК 580, ВА 93, ВА 325 и ВА 317; а также 66 семей М 2 селекционных линий, полученных с использованием химического мутагенеза (НЭМ).

Для оценки устойчивости подсолнечника к сульфонилмочевинам на стадии трех пар настоящих листьев проводилась обработка растений гербицидом Гранстар, СТС (д.в. трибенурон-метил, 750 г/кг, компания-производитель Du Pont) в дозировке 2Х (0,25 г/л, что соответствует около 34,6 г д.в./га или двойной рекомендуемой в производстве дозе). Опрыскивание проводили в утренние часы с помощью ранцевого пневматического опрыскивателя. Гербицид равномерно наносился на листья, включая точку роста растений. Оценка воздействия гербицида проводилась на 10-е сутки после обработки.

Результаты и обсуждение. При первичном скрининге коллекции ВНИИМК в 2008 г. было изучено четыре селекционные линии, два интродуцированных ис- точника и 66 семей М2 селекционных линий. Для поиска устойчивости к трибену-рон-метилу гербицидом были индивидуально обработаны около 700 растений подсолнечника. При визуальной оценке состояния растений после обработки гербицидом по шкале фитотоксичности выделялись два фенотипических класса: устойчивые – без видимых повреждений тканей растения, и погибшие – остановившиеся в росте растения с полным некрозом тканей.

Образцы-источники SURES-1 и SURES-2 показали полную устойчивость к Гранстару. Все растения обычных линий ВК 876, ВК 580, ВА 93, ВА 325, а также растения семей М 2 погибли в результате обработки гербицидом (табл. 1).

Таблица 1

Результаты скрининга коллекции подсолнечника по устойчивости к гербициду Гранстар

ВНИИМК, Краснодар, 2008 г.

Генотип	Число растений, шт.
	устойчивые	погибшие
SURES-1	34	0
SURES-2	29	0
ВК 876	0	22
ВК 580	0	34
ВА 93	0	27
ВА 325	0	36
66 семей М2	0	517

Таким образом, выявлено отсутствие мутантного гена устойчивости к сульфо-нилмочевинам в образцах генетической коллекции ВНИИМК.

Для изучения наследования признака устойчивости к сульфонилмочевинам, были обработаны Гранстаром растения F 1 и F 2 по нескольким комбинациям скрещиваний (табл. 2).

Гибриды F1 ВК 876 × SURES-1, ВА 93 × SURES-1, ВК5 80 × SURES-2 и ВА 325 × SURES-2, как и интродуцированные родительские формы, показали полную устойчивость к Гранстару. Кроме того, отсутствовал промежуточный фенотипический класс чувствительные (т.е. растения с различной степенью хлорозов и некрозов, а также повреждением центральной точки роста после обработки), который мог бы указывать на наличие генов-модификаторов или не доминантный тип наследования. Следовательно, характер наследования этого признака в F1 – полное доминирование устойчивости.

Расщепление в популяциях F 2 , полученных путём самоопыления растений F 1 по всем четырём комбинациям скрещиваний, также подтвердило моногенную схему наследования 3 устойчивых : 1 погибший (табл. 2).

Таблица 2

Наследование в F 1 и F 2 устойчивости растений подсолнечника к гербициду Гранстар

ВНИИМК, Краснодар, 2007–2008 гг.

Поколе-ние	Комбинация скрещивания	Число растений, шт.		χ2 3:1
		устойчивые	погибшие
	ВК 876 × SURES-1	41	0
	ВК 580 × SURES-2	20	0
F 1	ВА 93 × SURES-1	48	0	-
	ВА 325 × SURES-2	13	0
	ВК 876 × SURES-1	36	11	0,06 *
F 2	ВК 580 × SURES-2	30	11	0,07 *
	ВА 93 × SURES-1	30	7	0,72 *
	ВА 325 × SURES-2	29	12	0,39 *

* — Х 23:1 < Х 205 = 3,84

Для проверки гипотезы о полном доминировании признака устойчивости к трибенурон-метилу, была измерена высота растений родительских линий и растений F 1 по двум комбинациям скрещиваний (табл. 3).

Достоверное снижение высоты обработанных растений наблюдалось только у гербицидоустойчивой гомозиготной линии SURES-1 (табл. 3). Следует отметить отсутствие у этой линии погибших после обработки гербицидом растений (табл. 1). Очевидно, что такие различия в высоте растений являлись модификационными и зависели от количества гербицида, попавшего на растение. Расчёт эффекта действия гербицида показал, что в результате обработки растений линии SURES-1 гербицидом гранстар произошло снижение их высоты на 10 %.

Таблица 3

Высота растений родительских линий и гибридов F 1 при обработке гербицидом Гранстар

ВНИИМК, Краснодар, 2008 г.

Генотип	Высота растений, см		± к контролю	НСР 05
	контроль	обработка
SURES-1	115	104	11	7,6
SURES-2	104	87	17	18,8
ВК 876 × SURES-1 ВК 580 × SURES-2	136	129	7	10,0
	150	143	7	14,6

Однако в случаях с линией SURES-2 и гибридов F 1 по двум комбинациям скрещиваний достоверного снижения высоты растений после их обработки гербицидом Гранстар в 2Х дозировке не произошло, что подтверждает гипотезу о полном доминировании признака устойчивости к трибенурон-метилу.

Дальнейшая селекционная работа, включающая самоопыление и отбор, позволила получить к 2012 г. четыре семьи F 6 линий-закрепителей стерильности и пять семей F 6 линий-восстановителей фертильности. Эти новые линии являются донорами признака устойчивости к суль-фонилмочевинам у подсолнечника и включены в генетическую коллекцию ВНИИМК.

Более того, в настоящее время на завершающем этапе находится создание аналогов селекционных линий ЦЭБ ВНИИМК – ВК 876, ВК 680 и ВК 580, а также селекционных линий Армавирской опытной станции ВНИИМК – ВА 93, ВА 325 и ВА 317 (табл. 4).

Таблица 4

Устойчивые к трибенурон-метилу аналоги селекционных линий подсолнечника

ВНИИМК, Краснодар, 2012 г.

Линия-реципиент гена Sur	Поколение
Материнские линии
ВА 93	I 4 BC 5
ВК 876	I 3 BC 5
ВК 680	I 1 ВС 4
Отцовские линии
ВК 580	I 4 BC 5
ВА 317	I 2 BC 5
ВА 325	I 1 ВС 4

Заключение. Интродуцированные источники из США SURES-1 и SURES-2 показали полную устойчивость к сульфо-нилмочевиновому гербициду Пульсар (д.в. трибенурон-метил). Резистентность к трибенурон-метилу в F 1 и F 2 при скрещивании этих источников с селекционными линиями контролировалась одним полностью доминантным геном. Получены девять линий-доноров устойчивости к сульфонилмочевиновым гербицидам и завершена работа по созданию трибену-рон-метил устойчивых аналогов шести селекционных линий подсолнечника ВНИИМК.