Перспективы применения бактерий рода Bacillus в биоремедиации почв, загрязнённых свинцом

Сизенцов А.Н., Булгакова М.А., Сальникова Е.В. Перспективы применения бактерий рода Bacillus в биоремедиации почв, загрязнённых свинцом // Вестник Нижневартовского государственного университета. 2026. № 2(74). С. 50-59.

Антропогенная деятельность, включающая промышленные выбросы, применение пестицидов и неправильную утилизацию отходов, привела к повсеместному загрязнению почв тяжёлыми металлами [3]. Свинец (Pb), как один из наиболее распространённых и опасных загрязнителей, обладает выраженными токсикологическими свойствами, негативно влияя на здоровье живых организмов и функционирование всей экосистемы [10]. Его накопление в почве нарушает микробиологическую активность, снижает плодородие и представляет прямую угрозу передачи по трофическим цепям [11]. В связи с этим разработка эффективных и устойчивых методов очистки почв от загрязнения свинцом является приоритетной задачей современной экологии и природопользования.

Фиторемедиация и химическая экстракция имеют ряд ограничений, связанных с климатическими условиями, глубиной очистки и высокой стоимостью [12]. Биоремедиация, основанная на использовании метаболического потенциала микроорганизмов и растений, предлагает экономичную и экологически дружественную альтернативу [2]. Среди микроорганизмов особый интерес представляют спорообразующие бактерии рода Bacillus , известные своей устойчивостью к неблагоприятным условиям, высокой ферментативной активностью и способностью иммобилизовать или трансформировать тяжёлые металлы за счёт механизмов биосорбции, биопреципитации и внутриклеточного накопления [7].

Из-за высокой токсичности свинца не каждый организм способен его выдержать, но существуют несколько видов рода Bacillus , которые проявляют резистентность по отношению к этому металлу. Бактерии проявляют устойчивость к загрязнению свинцом за счет внеклеточного осаждения, испарения, биометилирования, связывания клеточной поверхности, внутриклеточной секвестрации и усиленной продукции сидерофора [15].

Bacillus spp. используют pbr оперон и активный транспорт в качестве потенциальных стратегий борьбы с токсическими эффектами Pb [4]. Микроорганизмы избавляются от него путем адсорбции через клеточную стенку, поскольку она состоит из органических макромолекул, включая полипептиды, полисахариды и белки, которые обладают способностью адсорбировать Pb с помощью электростатических сил, включая силы Ван-дер-Ваальса, ковалентные или ионные связи [4].

Однако эффективность и безопасность биоремедиационных технологий требуют всесторонней оценки, включая анализ их воздействия на почвенную мезофауну, являющуюся ключевым компонентом почвообразовательных процессов. Дождевые черви Eisenia fetida являются стандартным тест-объектом в экотоксикологических исследованиях согласно руководствам OECD и ISO [9; 14], так как они напрямую контактируют с почвой, обладают высокой чувствительностью к загрязнителям и играют важную роль в разложении органического вещества и аэрации почвы. Параметры их выживаемости, роста и поведения служат интегральными индикаторами качества среды.

Целью данного исследования была оценка воздействия бактериального препарата на основе Bacillus sp. и свинца, как по отдельности, так и в комбинации, на физиологическое состояние дождевых червей Eisenia fetida в контролируемых лабораторных условиях, для предварительной оценки потенциальных рисков и преимуществ применения данного бактериального штамма в биоремедиации свинец-загрязнённых почв.

Материалы и методы

Предварительный этап проводимых исследований был направлен на выделение металлрезистентных в отношении свинца штаммов Bacillus spp. из почвенных образцов с территории ПАО «Гайский горно-обогатительный комбинат», отобранных методом конверта. Выделение почвенных изолятов Bacillus spp. осуществляли путем термической обработки 100 г. средней навески в водяной бане при температуре 98 ° С в течении 90 минут. Один грамм навески почвенного образца суспендировали в 10 мл стерильной дистиллированной воды и проводили серию последовательных разведений от 1:10 до 1:10000. Высев исследуемых микроорганизмов осуществляли на накопительные питательные среды (ГРМ-агар Оболенск: панкреатический гидролизат рыбной муки, натрия хлорид, агар микробиологический), путем переноса 100 мкл суспензии с последующим инкубированием культуры при температуре 37 ° С в течение 24 часов и идентификацией микроорганизмов на основании культуральных характеристик и окраски по Граму.

Предварительную оценку уровня резистентности выделенных изолятов к химическим соединениям свинца с высоким уровнем диссоциации в водных растворах (Pb(NO 3 ) 2 , Pb(CH 3 COO) 2 ) осуществляли с использованием метода диффузии в агар (метод лунок) в комбинации с методом серийных разведений. В чашки Петри заливали 20 мл стерильного агаризованного субстрата (ГРМ-агар) с содержанием агар-агара 2,5%. На поверхность субстрата осуществляли высев исследуемых смешенных культур микроорганизмов рода 52

Bacillus spp. «газоном» путем переноса 100 мкл суспензии по МакФарланду (OD 0,1 при длине волны 625 нм). Микробиологическим пробойником в толще субстрата вырезали лунки, в которые вносили по 30 мкл исследуемых растворов с последующим инкубированием микроорганизмов в термостате при температуре 37 ° С в течение 24 часов. Учет реакции производили путем замера зон ингибирования роста микроорганизмов. Для отбора колоний обладающих высоким потенциалом металлрезистентности использовали метод «реплик» (метод Ледерберга). Специфика метода заключается в переносе популяции бактериальных клеток с одной чашки Петри на множество других с разными концентрациями исследуемых химических соединений, что в свою очередь позволяет быстро находить микроорганизмы, способных расти в присутствии в субстратах с высоким уровнем катионной нагрузки.

Для идентификации выделенных изолятов до уровня вида использовали метод MALDI-TOF масс-спектрометрия. При проведении MALDI-анализа выделенные изолированные культуры микроорганизмов смешивали с матрицей, обладающей оптической абсорбцией в диапазоне используемых длин волн. Процессинг интактных микроорганизмов в MALDI-TOF проводился с предварительной пробоподготовкой включающей добавление спирта, так как анализируемые микроорганизмы обладают высокой спорулирующей способностью. Анализ включал измерение размера и интенсивности пиков обнаруженных молекул с последующей идентификацией на основании выраженных различий маркеров «отпечатков пальцев» биоаналитов [1].

Подготовку чистой культуры B. licheniformis resistantPb осуществляли культивированием популяции бактериальных клеток в течение 48 часов на накопительных питательных средах, в качестве которых использовали ГРМ-агар, до наступления стационарной фазы роста. По окончании этапа культивирования биомассу клеток смывали с поверхности питательной среды путем добавления 2 мл стерильного 0,7% раствора NaCl с удалением биомассы стерильным шпателем Дригальского. Биомассу суспендировали в стерильных колбах с доведением оптической плотности до значения 0,1 OD при длине волны 625 нм, что соответствует степени разведения 0,5 по МакФакланду или 1,5 x 10 8 КОЕ/мл. Полученную суспензию вносили в почвенные образцы, в дозировке 100 мл/кг почвы, подвергнутые предварительному загрязнению свинцом в дозе 10 ПДК для почв (60 мг/кг), соответствующей выбор а в качестве источника факториальной ксенобиотической нагрузки использовали водный раствор Pb(CH 3 COO) 2 (ЧДА) (0,1098 г/ кг почвы) выбор которого обусловлен тем, что анионный компонент оказывает минимальное влияние на тестируемый штамм в условиях модельного эксперимента.

В работе использовалось четыре экспериментальные группы:

• 1.    Контроль: внесение в почву 50 мл дистиллированной воды с дальнейшим перемешиванием до однородности.

• 2.    Вариант 1 ( Bac ): внесение в почву 25 мл суспензии бактерий Bacillus sp. + 25 мл дистиллированной воды с дальнейшим перемешиванием до однородности.

• 3.    Вариант 2 (Pb): внесение в почву 25 мл раствора свинца (Pb) + 25 мл дистиллированной воды с дальнейшим перемешиванием до однородности.

• 4.    Вариант 3 (Pb+ Bac ): внесение в почву 25 мл раствора свинца, перемешивание образца, внесение 25 мл суспензии Bacillus sp. и повторное перемешивание.

Влажность почв корректировалась дважды в неделю путём добавления дистиллированной воды. После тщательного перемешивания субстрата с тестируемыми растворами в каждую ёмкость помещали по 10 здоровых половозрелых особей Eisenia fetida с развитым клителлумом, стандартизированных по размеру и массе. В течение всего 21-дневного эксперимента червей еженедельно докармливали овсяной мукой из расчёта 0,5 г на червя.

Наблюдения и измерения проводились на 3, 7, 14 и 21 сутки эксперимента. Регистрировались особенности поведения, выживаемость и масса червей. Обработка данных включала расчёт процентного изменения массы тела червей относительно контрольной группы и относительно их исходной массы на первые сутки эксперимента.

Статистическая обработка данных выполнена с расчетом средней арифметической и стандартной ошибки (SE).

Результаты и обсуждение

В рамках предварительных исследований, направленных на выделение и идентификацию почвенных изолятов микроорганизмов рода Bacillus , методом Ледерберга («реплик») с использованием насыщенных субстратов (ГРМ-агар с добавлением Pb(CH 3 COO) 2 (ЧДА) в дозах 0,250 моль, 0,125 моль и 0,063 моль) выделен штамм проявляющий максимальные показатели металлтолерантности, идентифицированный как B. licheniformis resistantPb. Проведенный сравнительный анализ устойчивости данного штамма к химическим соединениям свинца, позволил установить пороговые значения минимальных ингибирующих доз, так в отношении Pb(CH 3 COO) 2 она составила 0,125 моль, Pb(NO 3 ) 2 – 0,063 моль соответственно (табл. 1).

Важнейшим показателем приемлемости условий эксперимента и острой токсичности является выживаемость тест-организмов. В течение 21 дня эксперимента в контрольных ёмкостях не было зафиксировано ни одной гибели червей. Эталонная выживаемость в 100% сохранилась и во всех опытных вариантах ( Bac , Pb, Pb+ Bac ). Для оценки стимулирующего или угнетающего влияния обработок на рост червей был проведён анализ изменения их массы в процентах к среднему значению массы червей в контроле на соответствующие сутки (табл. 2).

Таблица 1

Сравнительный анализ токсичности исследуемых соединений свинца в отношении B. licheniformis resistantPb

соединения свинца
Pb(CH 3 COO) 2			Pb(NO 3 ) 2
Моль	концентрация Pb, г/М	зона ингибирования роста, мм	Моль	концентрация Pb, г/М	зона ингибирования роста, мм
1,000	63,697	31,26 ± 0,51	1,000	62,559	33,58 ± 0,95
0,500	31,849	23,49 ± 0,45***	0,500	31,280	27,74 ± 0,53**
0,250	15,924	14,92 ± 0,63***	0,250	15,540	20,30 ± 0,43***
0,125	7,962	9,22 ± 0,31***	0,125	7,820	15,52 ± 0,46***
0,063	3,981	R	0,063	3,910	8,91 ± 0,28***
0,031	1,991	R	0,031	1,955	R
0,016	0,995	R	0,016	0,978	R

Примечание: **p<0,01; *** p<0,001 (относительно предыдущей концентрации); R – резистентность (отсутствие зон ингибирования роста)

Таблица 2

Набор массы дождевых червей относительно контроля, %

Раствор / сутки	3	7	14	21
Bac	87,8±2,0	83,5±1,7	101,9±6,3*	104,3±4,8
Pb	117,1±4,5	104,8±7,6	68,8±2,3**	83,9±4,6*
Pb+ Bac	111,7±3,9	97,8±5,5	115,6±8,6	119,3±7,5

Примечание: *p<0,05; ** p<0,01

В экспериментальной группе Bac на 7 сутки отмечено незначительное снижение массы дождевых червей относительно контрольной группы, но к 14 суткам Eisenia fetida адаптируется к изменению микробного состава субстрата и показатели массы начинают превышать показатели контроля. Полученные результаты коррелируют с литературными данными и дают возможность предположить благоприятное влияние на загрязненные почвы бактериальной инокуляции в отдаленной перспективе [7].

Вариант опыта Pb оказал наиболее выраженное токсическое воздействие на культуру Eisenia fetida. В первые 7 суток эксперимента было отмечено существенное превышение контрольных значений (104,8%), однако уже к 14-му дню опыта масса червей резко сократилась до 68,8% и несмотря на то, что к концу наблюдений зарегистрирована частичная компенсация массы (83,9%), она оставалась ниже контрольного уровня. Проявленная динамика массы червей соответствует картине проявления токсического стресса [10].

Важнейший результат опыта был получен в комбинированной группе Pb+ Bac . На протяжении всего периода наблюдений зарегистрировано стабильное превышение показателей, так на 3-й день масса червей превосходила контроль на 11,7%, на 14-й – на 15,6%, а к 21 суткам – 19,3%. Таким образом присутствие бактерий штамма B. licheniformis resistantPb нивелирует токсическое действие свинца и стимулирует рост.

Наблюдение за изменением массы тела относительно первых суток позволяет зарегистрировать динамику биомассы во всех опытах в ходе эксперимента (табл. 3).

Таблица 3

Динамика массы дождевых червей относительно первых суток, %

Раствор / сутки	3	7	14	21
Bac	98,5±5,9	96,4±5,8	88,1±6,9	103,1±8,4
Pb	90,7±7,0	95,1±6,3	86,4±5,4	103,8±6,6
Pb+ Bac	92,7±6,8	91,3±7,6	50,0±3,1**	122,7±8,2***

Примечание: **p<0,01; *** p<0,001

В группах с B. licheniformis resistantPb и свинцом к 14-му дню было зарегистрировано снижение массы относительно первых суток 88,1% и 86,4% соответственно. В варианте Pb+ Bac несмотря на значительную утрату массы к 14-м суткам (50,0%), к концу опыта был отмечен рост показателя до 122,7%.

Таким образом, присутствие бактерий штамма B. licheniformis resistantPb в червеобитаемом субстрате не только останавливает существенное сокращение массы червей в следствии воздействия свинца, но и обеспечивает стабильное превышение контрольных значений на протяжении эксперимента. Биосорбционные свойства бактерии либо позволяют им связывать ионы свинца на поверхности клеток, либо переводят их малодоступные формы посредством биопреципитации, что, в любом из возможных вариантов, снижает фактическую концентрацию токсиканта в почвенном растворе [8; 16]. Кроме вышеобозначенного можно предположить, что бактериальная деструкция органического вещества почв сокращает энергетические затраты червей, что, вероятно, позволяет компенсировать затраты организма на стресс-реакцию [5; 6].

Заключение

Подводя итог можно говорить о том, что к 14-м суткам свинец ингибирует набор биомассы дождевыми червями подтверждая тем самым, свое токсическое воздействие. Однако, внесение B. licheniformis resistantPb в загрязненную свинцом почву нивелирует негативный эффект металла, что отражается в наборе массы червей, достигающей к 21-м суткам 119,3% относительно контроля. Полученные результаты свидетельствуют о высоком биоремедиационном потенциале исследованного штамма бактерий рода Bacillus , способного эффективно снижать токсичность свинца для почвенной мезофауны и стимулировать ее рост. Исследование подтверждает целесообразность использования биологических тест-систем, в частности Eisenia fetida , для объективной оценки эффективности и безопасности биоремедиационных технологий [5].

Перспективы дальнейших исследований должны быть направлены на изучение молекулярных механизмов взаимодействия штамма B. licheniformis resistantPb как с ионами свинца (иммобилизация, трансформация), так и с организмом дождевых червей. Необходимы прямые химические анализы содержания подвижных форм Pb в почве в

динамике, а также исследования на клеточном и биохимическом уровнях для полного раскрытия природы протекторного эффекта.

Работа выполнена в рамках Государственного задания (FSGU-2023-0007) соглашение с Минобрнауки России от 15.11.2023 № 075-03-2023-012/8