Подбор питательной среды для получения бактериального концентрата микробного консорциума

В современных условиях возросла доля заквасочных культур, полученных путем генной трансформации. С одной стороны, применение микроорганизмов с трансгенными свойствами ускоряет формирование функциональных свойств микроорганизмов, но, с другой стороны, такие микроорганизмы могут оказывать нежелательное воздействие на организм человека: аллергические реакции, подавление роста естественной микрофлоры организма. На этом фоне использование микроорганизмов естественной популяции микроорганизмов самоквасных кисломолочных продуктов остается актуальным источником производственно-ценных штаммов.

Ранее был разработан способ получения микробного консорциума для производства кисломолочных продуктов смешанного брожения. Идентификация состава лактобактерий микробного консорциума показала ее соответствие естественно сложившейся популяции микроорганизмов курунги и кумыса. Установлена ее способность подавлять рост патогенной и гнилостной микрофлоры [2, 3].

Следующий этап исследований - создание бактериального концентрата полученной популяции микроорганизмов. Сложность получения бактериального концентрата заключается в многокомпонентности микробного консорциума. Одним из ключевых моментов в разработке технологии бактериального концентрата является подбор питательной среды, обеспечивающий сбалансированный рост микрофлоры бактериального концентрата.

В полученной микробной популяции устойчиво доминирующими являются клетки мезофильных лактобактерий и лактозонеусваивающих дрожжей, не конкурирующих в потреблении лактозы, и неустойчивое количество термофильных лактобактерий и лактозных дрожжей [2].

Следовательно, при подборе питательной среды для микробного консорциума первоочередной задачей является обеспечение роста лактозонеусваивающих дрожжей и мезофильных лактобактерий.

Известно, что технологии приготовления хлеба из ржаной муки основаны на применении заквасок с использованием чистых культур лактобактерий и дрожжей. В состав заварок ржаной муки входят Lactobacillus plantarum, L. brevis, L. delbrueckii, L. fermentum, Saccharomy-ces cerevisiae и S. minor. Ржаная мука содержит комплекс питательных веществ, необходимых для развития как молочнокислых бактерий, так и дрожжей, характеризуется значительной долей в составе водорастворимых белков и углеводов [5].

Цель данной работы - изучение возможности применения ржаной муки в питательной среде для получения бактериального концентрата микробного консорциума.

Материалы и методы исследований

Объектом исследования явилась микробная популяция микроорганизмов, полученная автоселекцией при 30 ° С микрофлоры кефирной грибковой закваски в присутствии термофильных лактобактерий Lactobacillus acidophilus, L. bulgaricus, L. helveticus в соотношении 1:0,5:0,5:1 соответственно.

Для исследований применяли обойную ржаную муку по ГОСТ Р52809 Мука ржаная хлебопекарная. Технические условия.

В работе применялись общепринятые и стандартные методы для изучения физико-химических и микробиологических показателей.

Рост биомассы определяли путем измерения оптической плотности фотоколометриче-ским методом на KF-77 Х=550 нм.

Количественный учет лактозных и не усваивающих лактозу дрожжей проводили методом предельных разведений по числу колониеобразующих единиц (КОЕ) при высевах на плотные лактозно- и глюкозо-картофельные среды, молочнокислых бактерий на среде ГМК.

Влияние свойств клеток микроорганизмов на процесс адгезии изучали по методу В.И. Брилис [1].

Результаты и их обсуждения

Питательную среду готовили на осветленной творожной сыворотке с добавлением 1 г/л натрия лимоннокислого трехзамещенного, 1 г/л калия фосфорнокислого однозамещенного, 0,1 г/л магния сернокислого, 0,5 г/л сахарозы, 0,1 г/л аскорбиновой кислоты. В подготовленную смесь вводили разные дозы ржаной муки: 1% - образец 1; 2 % - образец 2; 3% - образец 3; без добавления ржаной муки - контрольный образец.

Исследуемые образцы стерилизовали при 120 ° С в течение 30 мин, охлаждали до 30 ° С, вносили 5% инокулята микробного консорциума и устанавливали рН6-6,5. Наращивание биомассы проводили при 30°С в течение 24 ч. Результаты исследования представлены на рисунках 1,2.

Время,ч

Образец 1                  ^{Образец 2}

Образец 3              контроль

Рисунок 1 – Динамика оптической плотности инокулированных питательных сред

Опыты

Опыты

Дрожжи, сбраживающие лактозу

Дрожжи, не сбраживающие лактозу

Дрожжи, сбраживающие лактозу

Дрожжи, не сбраживающие лактозу

а                                                    б

Рисунок 2 – Динамика микробиологических показателей инокулированных питательных сред: а – дрожжей; б – лактобактерий

Из рисунка 1 видно, что в образцах 1 и 2 наблюдается максимальное увеличение значения оптической плотности среды до 1,17 и 1,3 ед соответственно. В образце 3 через 24 ч культивирования значение оптической плотности питательной среды составило 0,8 ед, что на 0,07 ед меньше, чем в контрольном образце.

С первых часов культивирования видна разница в динамике роста популяции микробного консорциума в исследуемых образцах (рис. 2). Набольшее увеличение количества бактерий наблюдали в образце с 2% ржаной муки, количество дрожжей, не сбраживающих лактозу, составило 3∙10⁸ КОЕ/см³, термофильные и мезофильные лактобактерии - 5·10¹⁰ и 4·10¹¹ КОЕ/см³ соответственно.

В образце с 3% ржаной муки был установлен за 24 ч наименьший прирост лактобактерий и дрожжей, не сбраживающих лактозу, в сравнении с другими образцами.

Вероятно, это связано с гидрофильными свойствами углеводно-белкового комплекса ржаной муки, приводящими к снижению активности воды питательной среды.

Результаты исследования влияния состава питательной среды на изменение морфологических особенностей колоний микроорганизмов представлены на рисунке 3.

а) контроль

б) образец 1

в) образец 2

Рисунок 3 – Микрокартина исследуемых образцов

г) образец 3

Из микрокартины на рисунке 3 видно, что морфологически микробный консорциум представлен клетками дрожжей, тонкими палочками разной длины. Наибольшая агрегация клеток дрожжей и молочнокислых бактерий была установлено в образце 2 (рис. 3 в).

В образце 3 (рис. 3 г) также наблюдается скопление клеток дрожжей и лактобацилл, но дрожжевые клетки гораздо мельче по размеру по сравнению с микрокартиной других образцов.

Высокое содержание в ржаной муке водорастворимых пентозанов и белков дают вязкие растворы, что способствует, вероятно, агрегации клеток микробного консорциума и формированию матрикса.

Формирование микробных матриксов способствует быстрому обмену продуктами жизнедеятельности, защищает бактерии от негативных последствий воздействий окружающей среды. В природных условиях естественные популяции микроорганизмов предпочитают расти в прикрепленном состоянии на твердых поверхностях. Слизистые выделения этих клеток способствуют прикреплению к твердому субстрату, т.е. адгезии [4].

Адгезия микроорганизмов на твердых поверхностях является жизненно важным приспособлением адаптации различным средам обитания, обусловливает их стабильность и защитные свойства.

Для исследований использовали биомассу, полученную культивированием на питательных средах с добавлением 2% ржаной муки (образец 2) и без добавления ржаной муки (контроль). Результаты исследований представлены в таблице 1.

Таблица 1

Наименование показателя	Наименование опыта
	образец 2	контроль
Средний показатель адгезии	4,6	3,2
Коэффициент участия эритроцитов в адгезивном процессе, %	85	79
Индекс адгезивности микроорганизмов	5,4 + 1,1	4,0 + 1,5
Адгезивность	высокая	средняя

Адгезивные свойства микробного консорциума

Из таблицы 1 видно, что индекс адгезивности микробного консорциума в исследуемом образце выше контрольного на 0,6. Результаты исследования свидетельствуют о том, что присутствие ржаной муки в питательной среде стимулирует адгезивные процессы в микробном консорциуме.

Полученные данные показывают целесообразность применения ржаной муки при создании бактериального концентрата микробного консорциума. Качественная характеристика полученного бактериального концентрата представлена в таблице 2.

Таблица 2 Качественная характеристика жидкого бактериального концентрата

Наименование показателя		Значение показателя
Консистенция и внешний вид		однородная жидкость, допускается отделение сыворотки
Цвет		от кремового до светло-коричневого по всему объему, с темными включениями
Вкус и запах		кисломолочный с привкусом ржаной муки
Массовая доля сухих веществ, %		7,2±0,5
Активная кислотность (рН)		5-7
Температура сквашивания, ° С		28 + 2
Активность (продолжительность сквашивания 10 л при внесении концентрата с 1 ед активности), ч		10-12
Титруемая кислотность, ° Т		120
Температура при выпуске с предприятия, °С		плюс 6 + 2
Продолжительность хранения, мес.		3
Количество микроорганизмов, КОЕ/см3, не менее: тeрмофильныe лактобaктерии мeзофильныe лaктобaктерии дрoжжи, не сбрaживающие лактoзу дрoжжи, сбрaживающие лактoзу		5·1010 4·1011 3·108 2·107
Микрокартина		единичные тонкие палочки разной длины, единичные скопления дрожжей
Объем бакконцентрата в см3,  в  котором отсутствуют	БГКП (колиформы)	1,0
	S. aureus	1,0
	патогенные,  в  том  числе сальмонеллы	10,0

Из данных таблицы 2 можно сделать вывод, что полученный жидкий бактериальный концентрат характеризуется высокой концентрацией жизнеспособных клеток и ферментирующей активностью, что делает возможным его применение беспересадочным методом для производства кумыса и курунги, а также в качестве биологически активной добавки к пище.

Выводы

• 1.    Доказана возможность применения ржаной муки в питательной среде для наращивания биомассы микробного консорциума. Установлено, что внесение 2% ржаной муки в питательной среде способствует увеличению прироста биомассы микробного консорциума, активному росту мезофильных лактобактери до 5∙10¹¹ КОЕ/см³ и дрожжей несбраживающих лактозу до 3∙10⁸ КОЕ/см³.

• 2.    Присутствие 2% ржаной муки в питательной среде приводит к агрегации микробного сообщества и повышению их адгезивных свойств.

• 3.    Подобранные условия культивирования микробного консорциума позволяют получить бактериальный концентрат с высокой концентрацией жизнеспособных клеток и биохимической активностью.

• 4.    На основании полученных результатов оформлен патент №2524435 «Способ получения бактериального концентрата и применение его в качестве БАД к пище или закваски прямого внесения».