Полиморфизм генов TLR4 и TNF-α, ассоциированных со здоровьем копытец крупного рогатого скота

Основным пусковым механизмом развития воспалительного процесса у коров выступает ацидоз рубца [4]. Это состояние возникает при избыточном потреблении легкопереваримых углеводов, что приводит к резкому снижению pH в рубце – ниже 5,5. В таких условиях происходит массовая гибель симбиотических бактерий и выделение большого количества бактериального липополисахарида (LPS) [5, 6].

Высвобожденный LPS проникает в кровеносную систему через поврежденную стенку рубца. В крови он связывается с Toll-подобным рецептором 4 (TLR4), который экспрессируется на поверхности макрофагов и эндотелиальных клеток [7]. Активация TLR4 запускает каскад внутриклеточных сигналов, приводящий к активации фактора транскрипции NF-kB [4, 8]. Установлено, что полиморфный вариант гена TLR4 аллель B, ассоциирована к конформационным изменениям Toll-подобного рецептора 4, вследствие чего происходит повышение его связывания с LPS, вызывая чрезмерную активацию NF-kB и увеличивая риск ламинита [9, 10]. Помимо негативного влияния на здоровье копытного аппарата, этот ген-маркер ассоциирован так же с рядом хозяйственно-полезных признаков крупного рогатого скота [11].

Активированный NF-kB инициирует экспрессию генов провоспалительных цитокинов, среди которых ключевую роль играет фактор некроза опухоли-альфа (TNF-a). Этот цитокин становится центральным медиатором воспалительного ответа [12]. TNF-a вызывает повышение проницаемости сосудов, что приводит к отеку дермального слоя копытец. Одновременно он стимулирует активность матриксных металлопротеиназ (MMP-2 и MMP-9), которые разрушают коллагеновые структуры копытного дермиса [1].

Важным патогенетическим звеном является способность TNF-a вызывать вазоконстрикцию. Это приводит к нарушению кровоснабжения тканей копытец, развитию ишемии и последующему некрозу. Хроническое воспаление завершается структурными изменениями в копытном роге – его деформацией, что клинически проявляется болезненностью, хромотой и образованием язв подошвы [8, 13].

Полиморфизм A/G в промоторной области гена TNF-a (генотип AA) имеет взаимосвязь с двукратным повышением TNF-a в сыворотке крови у коров с язвами подошвы [3]. Так же установлено, что полиморфные вариации гена TNF-a (-824 A/G) влияют на экономически значимые признаки голштинского скота [14].

Выявление аллельных вариантов генов TLR4 и TNF-a дает научную основу для создания генетического прогнозирования и профилактики болезней копыт у крупного рогатого скота.

Цель работы - изучить полиморфизм генов TLR4 и TNF-a и их комплексных генотипов у коров голштинской породы.

Условия, материалы и методы. В исследовании были использованы образцы цельной крови 147 голов коров-первотелок голштинской породы СХПК «Племенной завод им. Ленина» Атнинского района Республики Татарстан. Кровь отбирали из хвостовой вены в вакуумные пробирки «Vacuette tube K-3E» («Грейнер Био-Уан ГмбХ», Австрия), содержащие ЭДТА. В лаборатории отдела физиологии, биохимии, генетики и питания животных ТатНИИСХ ФИЦ КазНЦ РАН были выполнены: экстракция ДНК коммерческим набором «АмплиСенс» ДНК-Сорб В (производство ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) по стандартному протоколу, а также полимеразная цепная реакция с последующим ПДРФ-анализом.

Определение полиморфизмов в локусах генов TLR4 (c.9421C/T) и TNF-a (-824 A/G) осуществляли методом ПЦР, с последующим расщеплением полученных продуктов ферментом Alu I («СибЭнзим», Россия). Состав ПЦР-смесей содержал матричную ДНК, нуклеотидную смесь dNTPs, Taq-полимеразу с фирменным буфером («СибЭнзим», Россия), а также гено-специфичные праймерные системы («Евроген», Россия) для каждого из генов [15, 16]. Амплифицирование проводили на программируемом оборудовании «MyCycler» и «T100 Thermal Cycler» (BIO RAD, США) в оптимально подобранных температурно -временных режимах [11, 14].

Разделение рестрикционных фрагментов проводили в горизонтальных электрофоретических камерах (Helicon, Россия), после чего результаты фиксировали и документировали при помощи компьютерной системы визуализации «GelDoc Go» с программным обеспечением «Image Lab Touch» V. 3.0 (BIO RAD, США).

Популяционно-генетический анализ стада включал расчет частоты аллелей и генотипов, оценку параметров генетического разнообразия, а также тестирование соответствия закону Харди-Вайнберга наблюдаемого распределения генотипов ожидаемому по критерию χ² . Так же поголовье было оценено по индексу фиксации, или коэффициент инбридинга ( Fis ), и на информативность полиморфизма ( PIC ) по каждому отдельно взятому гену-маркеру.

Результаты и обсуждение. В результате генотипирования были получены следующие данные (табл. 1). Для генотипов AA, AB и BB гена TLR4 установлена частота встречаемости 21,8%, 51,0 и 27,7% соответственно. По этому гену наблюдается сбалансированность аллелей A и B - 0,473 и 0,527 соответственно.

Наблюдаемая гетерозиготность составила 0,510, а ожидаемая находилась на уровне 0,499, что указывает на высокое генетическое разнообразие. Критерий х² = 0,084, что свидетельствует об отсутствии отклонения в популяции по гену TLR4 согласно закону Харди-Вайнберга. Показатель полиморфизма ( PIC = 0,373) говорит о том, что локус умеренно информативен.

По гену TNF-a максимальная частота встречаемости у гомозиготных GG-особей -66,7%, а минимальное количество являются носителями гомозиготного генотипа AA – 3,4%. Промежуточное положение у гетерозиготного генотипа AG, его частота составила 29,9%, что соответствует уровню наблюдаемой гетерозиготности в популяции 0,229. При этом ожидаемая гетерозиготность находилась на уровне 0,300, что считается умеренным разнообразием. Критерий х2 = 0,001, характеризуя популяцию, как находящуюся в генетическом равновесии. В поголовье наблюдается нижняя граница умеренной информативности ( PIC = 0,255) из-за доминирования аллеля G (0,816).

Таблица 1 – Распределение аллелей, генотипов и параметры разнообразия стада по генам

TLR4 и TNF-a

	Генотипы						Аллели		X2	Fis	PIC
	n	%	n	%	n	%
TLR4 (Toll-подобный рецепто								р 4)
	AA		AB		BB		A	B	0,084	-0,022	0,374
Н	32	21,8	75	51,0	40	27,2	0,473	0,527
О	33	22,4	73	49,9	41	27,8
TNF-a (Фактор некроза опухоли-альфа)
	AA		AG		GG		A	G	0,001	0,003	0,255
Н	5	3,4	44	29,9	98	66,7	0,184	0,816
О	5	3,4	44	30,0	98	66,6

Примечание: Н - наблюдаемое; О - ожидаемое; х2кpит(a=0,05) = 3,84; Fis — коэффициент инбридинга; PIC - мера информативности полиморфизма (0 - маркер мономорфен, 0,25-0,50 -умеренно информативный маркер, 0,50 и выше - высокоинформативный маркер).

Анализ полиморфизма гена TLR4 показал отрицательный коэффициент инбридинга ( Fis , индекс фиксации) -0,022, что указывает на лёгкий избыток гетерозигот по сравнению с ожидаемым распределением. Вероятно, что возможными причинами являются отрицательный ассортативный подбор (скрещивание разнородных особей) или искусственный отбор. По гену TNF-a установлен положительный низкий коэффициент инбридинга

0,003, что свидетельствует о практически полном соответствии ожидаемой и наблюдаемой гетерозиготности. Это позволяет сделать вывод, что инбридинг по локусам генов TLR4 и TNF-a в стаде отсутствует.

В таблице 2 показаны данные по наблюдаемому распределению комбинаций генотипов для генов TLR4 и TNF-a в выборке из 147 голов коров-первотелок.

Таблица 2 - Наблюдаемое распределение комплексных генотипов генов TLR4/TNF-a

		TLR4
T	n	AA	AB	BB	T
N	AA	1	1	3	N
F	AG	11	26	7	F
-	GG	20	48	30	-
α					147       α

TLR4

%	AA	AB	BB
AA	0,68	0,68	2,04
AG	7,48	17,69	4,76
GG	13,61	32,65	20,41
				100,00

Наиболее часто встречаемые сочетания генотипов генов TLR4/TNF-a : AB/GG (48 гол., 32,65%), и BB/GG (30 гол., 20,41%). Реже всего встречаются особи с комплексными генотипами AA/AA и AB/AA (по 1 гол., 0,68%).

Рассчитанные теоретически ожидаемые частоты генотипов для тех же генов представлены в таблице 3. Некоторые сочетания имеют расхождения с наблюдаемыми данными. Так, например, для генотипов AB/AA наблюдается одна голова (0,68%), а в ожидаемом распределении – три головы (1,74%), а для BB/GG в наблюдаемом распределении 30 гол. (20,41%), а в теоретическом – 27 гол. (18,14%).

Таблица 3 - Ожидаемое распределение комплексных генотипов генов TLR4/TNF-a

	TLR4
n	AA  AB  BB
T N  AA	1         3       1
F  AG	10     22    12
-    GG	21     50   27
α
		147

TLR4

T N	%	AA	AB	BB
	AA	0,74	1,74	0,93
F	AG	6,52	15,27	8,14
- α	GG	14,51	34,01	18,14
					100,00

В целом тенденция по частоте встречаемости комплексных генотипов генов TLR4 и TNF -a , имеющих максимальную долю в стаде в наблюдаемом распределении, сохраняется и в ожидаемом.

Различия между наблюдаемым и ожидаемым распределением статистически не значимы при стандартном уровне %² _крит( a = 0,05) = 9,49 (так как /² = 8,70). Однако есть слабые признаки отклонений, возможно, из-за малых частот для генотипов AA/AA и BB/AA.

Выводы. В ходе проведенного исследования полиморфизмов генов TLR4 (c.9421C/T) и TNF-a (-824 A/G) установлено, что изучаемое стадо голштинского скота представлено носителями всех генотипов и их комплексных сочетаний, что свидетельствует о генетическом биоразнообразии в популяции.

По гену TLR4 наблюдается сбалансированное распределение аллелей (A – 0,473, B – 0,527), высокая наблюдаемая гетерозиготность (AB = 51,0%), близкая к ожидаемой. Для гена TNF-a установлено доминирование аллеля G

(0,816) над аллелем A (0,182) и низкая доля гетерозигот (AG = 29,9%).

Оба гена находятся в равновесии Харди-Вайнберга. Низкий коэффициент фиксации ( Fis ≈ 0) указывает на отсутствие инбридинга. Это может указывать на отсутствие близкородственного скрещивания и возможное влияние искусственного отбора.

Анализ генетических вариаций этих ключевых иммунных регуляторов позволяет выявлять животных с повышенной предрасположенностью к воспалительным поражениям копыт, разрабатывать персонализированные программы кормления и содержания, а так же проводить направленную селекцию, учитывающую генетическую устойчивость к метаболическим нарушениям.

Проведенные исследования представляют собой важный этап в создании научнообоснованной системы профилактики заболеваний ног и копытец у крупного рогатого скота, основанной на современных достижениях молекулярной генетики.