Получение гаплоидных растений Rubus arcticus L. методом культуры микроспор in vitro

Княженика арктическая (Rubus arcticus L.) относится к ценным ягодным растениям. Несмотря на относительно небольшой срок ее ис-

^* Работа выполнялась при поддержке РФФИ (проект ¹ 18-416-440002 р_а).

пользования в качестве плантационной культуры, получено несколько высокопродуктивных сортов. Княженика арктическая служит донором ре-монтантности и отличных вкусовых качеств при межвидовой гибридизации с Rubus idaeus L., однако передает потомству низкую урожайность. Основное направление селекции R. arcticus — повышение урожайности растений, в связи с чем ускорение селекционного процесса и использование гаплоидов для селекции перекрестноопыляемых растений имеет особое значение (1-3). Применение технологии удвоенных гаплоидов позволяет преодолеть ряд селекционных трудностей. Гомозиготные линии на основе гаплоидов могут быть получены за 2-3 года (4). При этом, по мнению ряда исследователей, использование андроклинных регенерантов — единственный способ сохранить гетерозисный эффект ценной гибридной линии (5).

Работы, посвященные проблеме получения гаплоидных растений, объединяет общий план построения опытов: воздействие повышенными и/или пониженными температурами, химическая обработка донорных растений, изменение состава питательной среды (регуляторов роста, углеводных составляющих), подбор возрастной стадии развития пыльника и микроспоры. К настоящему времени опубликованы методики получения гаплоидных растений пшеницы (5, 6), капусты (7-9), рапса (10), риса (11), моркови (12-14). Работы, посвященные получению гаплоидных растений R. arcticus L. в культуре микроспор, отсутствуют.

Факторов, влияющих на активизацию процессов переключения микроспор с гаметофитного пути развития на спорофитный, очень много, например, влияние видов и концентраций регуляторов роста (15-17), источников углеводного питания (18-20).

Ранее нами были предложены методические подходы для клонального микроразмножения R. arcticus (21). В развитие этих исследований в настоящей работе мы впервые получили гаплоидные растения-регенеранты R. arcticus в культуре микроспор, оптимизировав концентрацию 6-бензиламинопурина и источник углеводного питания для индукции эм-бриоидогенеза.

Нашей целью была разработке методики получения гаплоидных растений Rubus arcticus L. в культуре микроспор.

Методика . Исследования проводили в 2018 году. Использовали сорта княженики арктической Пима (Pima), Меспи (Mespi), выведенные в Финляндии, и Астра (Astra) из Швеции. Микроспоры выделяли из пыльников, которые отбирали из бутонов разного возраста и размера.

Для снижения контаминации при введении в культуру in vitro и возможности круглогодичного получения бутонов использовали метод выгонки (22), при котором растения, высаженные в горшки, после завершения цветения инкубировали в течение 30 сут при температуре 4 ° С. После холодовой обработки такие растения снова образовывали генеративные побеги.

Стерилизацию бутонов проводили по схеме: 1 мин в 70 % водном растворе этанола, 15 мин в 5 % водном растворе гипохлорита натрия или калия, затем их промывали в стерильной дистиллированной воде не менее трех раз. Выделенные пыльники собирали в микропробирки типа Эп-пендорф объемом 1,5 мл по 60 шт. и измельчали с помощью ручного гомогенизатора, одноканальным микродозатором Proline 20-200 («Sartorius Proline», Финляндия) добавляли 0,5 мл стерильной воды с глюкозой в концентрации 30 г/л. После этого пробирки центрифугировали (мини- центрифуга-вортекс Microspin FV-2400, SIA «BioSan», Латвия) 15 с при 4500 об/мин. Из каждой пробирки микродозатором переносили суспензию с микроспорами в культуральный сосуд объемом 10 мл (суспензию из одной пробирки помещали в один культуральный сосуд). Плотность суспензии составляла примерно 80000 микроспор/мл. Для изоляции пыльников с последующим выделением микроспор использовали бутоны длиной от 9 до 12 мм за 4-5 сут до начала распускания.

На каждом этапе in vitro культивирования микроспор менялся состав питательной среды и используемых регуляторов роста. При введении в культуру in vitro для активации морфогенеза использовали питательную среду Мурасиге-Скуга (MС) (23), дополненную 100 мг/л мезоинозита, 2 мг/л глицина, 0,5 мг/л тиамина, 0,5 мг/л пиридоксина, 30 г/л глюкозы и 5,0 г/л агара, рН от 5,8. В качестве регулятора роста использовали 6-бен-зиламинопурин (6-БАП) в концентрации от 0,50 до 2,00 мг/л («AppliChem GmbH», Германия). После появления эмбриоидов использовали среду MС («AppliChem GmbH», Германия) с содержанием макро- и микроэлементов в полной концентрации и в уменьшенной до 75 и 50 % по прописи (23). При исследовании влияние источника углеводного питания на рост и развитие эмбриоидов использовали глюкозу, сахарозу и мальтозу в концентрациях 20, 30 и 40 г/л.

Микроспоры, эмбриоиды и растения-регенеранты выращивали при освещенности 1500 лк, фотопериоде 16 ч (день)/8 ч (ночь) и температуре около 25 ° С. На этапе введения в культуру in vitro, роста и развития эмбриоидов использовали стеклянные культуральные сосуды объемом 10 мл, на этапе роста растений-регенерантов — культуральные сосуды объемом 100 мл.

Хромосомы подсчитывали в меристемной зоне корня растений-регенерантов. Корни помещали в фиксатор Карнуа (24) и выдерживали в течение 24 ч. Затем промывали в течение 20 мин под проточной водой, помещали в смесь ферментов (0,3 % пектиназы, 0,3 % мацеразы, 0,3 % целюлазы + цитратный буфер) и инкубировали в течение 2 ч при температуре 37 ° С. После этого корни на 3 мин помещали в 60 % уксусную кислоту, где материал измельчали препаровальной иглой, обводили фиксатором 3:1, встряхивали, промывали в абсолютном спирте, подсушивали, окрашивали метиленовым синим, промывали в дистиллированной воде и подсчитывали число хромосом (24) (световой микроскоп Биомед-3, «Биомед», Россия). Для подсчета числа хлоропластов использовали высечки из листьев диаметром 5 мм, с каждого растения делали по 5 высечек. Высечки окрашивали йодным красителем. Растущие в культуре in vitro растения-регенеранты фотографировали цифровой камерой Samsung NX-10 («Samsung», Южная Корея).

Экспериментальные данные представлены в виде средних арифметических значений ( М ) с указанием ошибки среднего (±SEM) и коэффициента вариации ( Cv ). Расчет доверительного интервала на основании t -распределения Стьюдента при уровне значимости р <  0,05 проводили с использованием статистического пакета программы Microsoft Excel 2010.

Результаты. В начале эксперимента подсчитывали число микроспор в пыльниках и сопоставляли стадии развития микроспоры с длиной бутонов. При числе пыльников у R. arcticus от 70 до 86 шт. и длине бутона от 1,0 до 1,4 мм количество зрелой пыльцы в одном пыльнике составляло от 590 до 710 шт. Мы выделили четыре основных стадии развития микроспоры (рис. 1): 1-я стадия — тетрада (в бутонах длиной от 4 до 5 мм); 2-я стадия — невакуолизированная микроспора с центральным локализованным расположения ядра (в бутонах от 5 до 7 мм); 3-я стадия — сильно вакуолизированная микроспора с утолщенной стенкой, крупной вакуолью и небольшим ядром, расположенным латерально (в бутонах от 7 до 8 мм); 4-я стадия — трехклеточная пыльца (в бутонах длиной более 8 мм) (рис. 1).

А

Б                           В

Рис. 1. Микроспоры княженики арктической ( Rubus arcticus L.) сорта Astra на питательной среде Мурасиге-Скуга (сахароза — 30 г/л, 6-бензиламинопурин — 1,5 мг/л, рН 5,8): А — стадия тетрады, Б — сильно вакуолизированная микроспора, В — зрелая пыльца (увеличение ½600, световой микроскоп Биомед-3, «Биомед», Россия).

• 1.    Морфогенез микроспор княженики арктической (Rubus arcticus L.) разных сортов на питательной среде Мурасиге-Скуга в зависимости от концентрации 6-бензиламинопурина (6-БАП)

• 2.    Рост эмбриоидов княженики арктической ( Rubus arcticus L.) сорта Astra в культуре in vitro на питательной среде Мурасиге-Скуга в зависимости от концентрации макро- и микроэлементов и источника углеводного питания

  Концентрация макро- и микроэлементов, %	Вид и концентрация углеводов, г/л	Начало роста эмбриоидоидов, сут		Появление листочков, сут		Общая длина через 40 сут культивирования, мм
  		M ±SEM1, 2	Cv , %	M ±SEM1, 2 Cv , %		M ±SEM1,2	Cv , %
  100	Сахароза, 20	55±3	13,2			1,0±0,5a	29,1
  	Сахароза, 30	41±2a	10,3			1,0±0,5a	11,3
  	Сахароза, 40	40±1a	5,4	63±3a	3,4	2,0±0,6ab	7,1
  	Мальтоза, 20	37±2a	12,3	60±3a	7,6	3,0±0,3b	5,3
  	Мальтоза, 30	19±1b	5,4	49±2b	2,1	3.0±0,5b	5,6
  	Мальтоза, 40	20±1b	4,2	49±3b	6,4	4.0±0,5b	8,0
  	Глюкоза, 20	25±3b	14,1	49±4ab	11,9	2,0±1,0ab	14,6
  	Глюкоза, 30	17±2b	10,2	47±4ab	9,5	3,0±0,3b	7,5
  	Глюкоза, 40	20±2b	9,8	48±4b	8,7	4,0±0,4b	5,9

Сорт	Концентрация 6-БАП, мг/л	Появление эмбриоидов, сут		Число эмбриоидов, образовавшихся на 60-е сут, шт.
		M ±SEM1, 2	Cv , %	M ±SEM1, 2	Cv , %
Astra	0,50	63±2a	7,8	5±1c	11,2
0,75		58±1ab	4,5	12±2ac	4,5
1,00		55±1bc	10,0	14±2ac	6,3
1,25		51±2c	9,2	23±3b	5,6
1,50		51±3bc	7,8	20±1b	7,2
1,75		51±3bc	8,2	9±2c	8,7
2,00		0	0	0	0
Pima	0,50	65±3	2,6	4±1a	9,1
0,75		54±2a	4,6	7±2ab	12,4
1,00		53±2a	7,1	8±2ab	9,3
1,25		53±1a	8,6	18±1	9,7
1,50		54±2a	5,8	9±1b	6,5
1,75		54±2a	4,3	8±2ab	7,7
2,00
Mespi	0,50	63±2a	12,2	10±2a	5,4
0,75		60±1a	12,1	13±2ab	6,5
1,00		57±2ab	10,1	15±2ab	6,4
1,25		53±2b	9,3	20±1	7,6
1,50		52±1b	6,5	14±1b	3,8
1,75		53±2b	3,4	14±2b	5,1
2,00		63±2a	7,8	5±1c	11,2

П р и м е ч а н и е. Концентрация сахарозы — 30 г/л, рН 5,8. Каждый вариант опыта выполнен в 3-кратной повторности, плотность микроспор 40000 в 0,5 мл. Прочерки означают гибель эксплантов. 1 — доверительный интервал на основе t -распределения Стьюдента при р ≤ 0,05; 2 — показатели в столбце, отмеченные одинаковыми буквами (a, b, c), не имеют статистически значимых различий при р ≤ 0,05 согласно t -критерию Стьюдента.

Наибольшее число образовавшихся эмбриоидов на 50-53 сут культивирования было достоверно больше во всех сортах на среде, содержащей 6-БАП в концентрации 1,5 мг/л (табл. 1). Визуально эмбриоиды обнаруживали, начиная со стадии «сердечко», когда их размер достигал 0,5 мм. Достоверного влияния генотипа на морфогенез микроспор в культуре in vitro мы не выявили. Специального изучения влияния стадии развития микроспоры на морфогенетическую активность мы не проводили. Необходимо отметить только то, что микроспоры, которые помещали на питательную среду, в подавляющем большинстве находились на стадии вакуолизации.

В исследованиях для индукции эмбриогенеза и получения вторичных эмбриоидов активно используются разные концентрации 6-БАП в качестве регулятора роста (25). В нашей работе 6-БАП индуцировал прямой эмбриоидогенез.

А

Б

Рис. 2. Этапы развития гаплоидов княженики арктической ( Rubus arcticus L.) сорта Astra в культуре in vitro на питательной среде Му-расиге-Скуга: А — эмбриоиды на стадии сердечко и торпедо (6-бензиламинопурин — 1,5 мг/л, рН 5,8; увеличение ½100, световой микроскоп Биомед-3, «Биомед», Россия), Б — эмбриоид, длина 5 мм (6-бензиламинопу-рин — 1,5 мг/л, рН 5,8, глюкоза — 30 г/л); В — растение-регенерант (6-бензиламинопурин — 1,5 мг/л, рН 5,8, глюкоза — 30 г/л).

Нами также установлено, что более интенсивные ростовые процессы происходили на питательной среде с содержанием макро- и микроэлементов, уменьшенным до 75 %, при концентрации глюкозы 30 г/л. В этом варианте рост эмбриоидов отмечали на 12-е сут культивирования, что достоверно отличалось от других вариантов. На 40-е сут их размер достигал 5 мм (рис. 2). Однако наименьшая гибель эмбриоидов наблюдалась на среде с полным составом макро- и микроэлементов (табл. 2).

Продолжение таблицы 2 75 Сахароза, 20 Сахароза, 30 43±3a 6,8 60±3a 13,2 3,0±0,3a 11,2 Сахароза, 40 40±2a 8,2 60±4a 12,5 3,0±0,3a 8,4 Мальтоза, 20 Мальтоза, 30 21±2b 5,5 46±2b 5,6 4,0±0,4abc 9,8 Мальтоза, 40 20±2b 4,3 46±2b 8,1 5,0±0,5bc 12,3 Глюкоза, 20 25±3b 11,2 46±3b 10,3 4,0±0,3ab 5,3 Глюкоза, 30 12±2c 5,2 44±1b 7,0 5,0±0,2c 7,9 Глюкоза, 40 15±2c 8,7 45±2b 6,2 5,0±0,5bc 9,2 50 Сахароза, 20 Сахароза, 30 Сахароза, 40 52±2a 10,3 80±5a 12,5 3,0±0,4a 13,9 Мальтоза, 20 Мальтоза, 30 58±1 5,4 73±2a 6,7 3,0±0,4a 9,4 Мальтоза, 40 50±2a 7,9 70±1a 8,3 3,0±0,5a 6,7 Глюкоза, 20 41±2b 6,3 Глюкоза, 30 39±2b 7,5 Глюкоза, 40 35±3b 4,3 62±2 5,9 4,0±0,3a 5,7 Примеч а н и е. Концентрация 6-бензиламинопурина — 1,5 мг/л, рН 5,8. Каждый вариант опыта вы- полнен в 3-кратной повторности. Прочерки означают гибель эксплантов. 1 — доверительный интервал на основе t-распределения Стьюдента при р ≤ 0,05; 2 — показатели в столбце, отмеченные одинаковыми буквами (a, b, c), не имеют статистически значимых различий при р ≤ 0,05 согласно t-критерию Стьюдента.

А                     Б

В                         Г

Рис. 3. Хромосомы делящихся клеток меристематической зоны корня на стадии метафазы (А, В, увеличение ½1000) и замыкающие клетки устьиц с хлоропластами (Б, Г, увеличение ½630) у полученных растений-регенерантов княженики арктической ( Rubus arcticus L.) сорта Astra: А, Б — диплоид (2 n = 14, число хлоропластов в замыкающих клетках — 10), В, Г — гаплоид ( n = 7, число хлоропластов в замыкающих клетках — 4). Световой микроскоп Биомед-3 («Биомед», Россия).

Многие авторы отмечают положительное влияние повышенного осмотического давления, которое создается при концентрациях сахарозы от 10 до 17 %, на появление эмбриоидов (26-28), однако в наших опытах эмбриоидо-генез у R. arcticus активно происходил при концентрации 3 %, а уже при 4 % скорость развития уменьшалась. Такое расхождение в результатах может объясняется тем, что мы изучали этап перехода от стадии эмбриоида к растению-регенеранту, а не этап образования эмбриоида из микроспоры.

Плоидность растений-регенерантов определяли подсчетом числа хромосом и числа хлоропластов в замыкающих клетках устьиц (рис. 3). Варьирование по числу хлоропластов в замыкающих клетках устьиц у диплоидных растений составляло от 8 до 12 шт., у гаплоидных — от 2 до 6 шт. Возможность использования косвенного метода для подтверждения плоидности доказана в ряде работ (29-31).

Проведенные исследования не позволяют идентифицировать, на какой именно стадии развития микроспоры лучше получать гаплоидные растения княженики, однако это имеет важное значение для определения факторов, влияющих на переключение программы развития микроспоры с гаметофитной на спорофитную (17, 19, 28, 32). Можно только отметить, что большая часть микроспор находилась на стадии вакуолизации. Одним из основных факторов переключения на спорофитный путь развития у микроспор княженики было использование регулятора роста 6-бензил-аминопурина и глюкозы в качестве источника углеводного питания. Критически важным моментом при получении гаплоидных растений становится не только получение эмбриоидов, но и сохранение их жизнеспособности и морфогенетической активности при переносе на свежую питательную среду (33). Согласно нашим результатам, для его успешного прохождения необходимо снижение концентрации макро- и микроэлементов в питательной среде до 75 %, тогда как уменьшение до 50 % приводит к снижению жизнеспособности.

Таким образом, для получения гаплоидных растений-регенерантов Rubus arcticus L. сортов Pims, Mespi и Astra целесообразно использовать питательную среду Мурасиге-Скуга, обогащенную 6-бензиламинопурином в концентрации 1,5 мг/л, что дает выход от 18±1 до 23±3 эмбриоидов на 40000 микроспор. Для получения растений-регенерантов из эмбриоидов необходимо использовать среду Мурасиге-Скуга с уменьшенным до 75 % содержанием макро- и микроэлементов, глюкозу в концентрации 3040 г/л, 6-бензиламинопурин — 1,5 мг/л, что позволяет индуцировать рост эмбриоидов за самое короткое время культивирования, а к 40-м сут получить эмбриоиды длиной 5±0,2 мм. Результаты выполненного исследования и предложенная нами методика могут использоваться при создании удвоенных гаплоидов других сортов R. arcticus для включении в селекционногенетические программы.