Посттравматическая регенерация костной ткани (часть 1)

E-mail: steinle@mail.tomsknet.ru

ПОСТТРАВМАТИЧЕСКАЯ РЕГЕНЕРАЦИЯ КОСТНОЙ ТКАНИ (ЧАСТЬ 1)

Томский военно-медицинский институт, г. Томск

Проблема посттравматической регенерации костной ткани приобретает особое значение в связи с ростом локальных вооруженных конфликтов, терроризма, техногенных катастроф и, наряду с фундаментальным научным интересом, имеет социально-экономическую актуальность, связанную с необходимостью медицинской реабилитации, длительного и дорогостоящего лечения [65]. Целостный анализ остеогистогенеза после ранений, переломов и других повреждений, поиск и обоснованное применение средств, управляющих регенерацией костной ткани, возможны на основании углубленных знаний общих закономерностей гистогенеза [23, 32, 50, 60, 61], а также реактивных изменений костной ткани в процессе регенерации [5, 33, 46].

Изучение морфологических изменений при восстановлении перелома кости, проведенное с использованием различных методических подходов, позволило получить представления о стадийности регенерационного процесса на 2 этапа: 1-й – образование регенерата, в котором различают фазу образования соединительнотканной мозоли и превращение ее в костную, на 2-м этапе происходит перестройка предварительной мозоли в окончательную. Предлагалось выделение пяти этапов: 1 – образование ткани, сходной с мезенхимой; 2 – дифференциация клеточных элементов этой ткани; 3 – образование первичных костномозговых полостей; 4 – перестройка провизорной мозоли; 5 – обратное развитие костной мозоли [66]. Согласно патоморфологическому анализу заживления костных переломов, выделяется шесть стадий восстановления дефекта кости: 1 – дестабилизация клеточных элементов; 2 – клеточная пролиферация; 3 – дифференциация разного вида тканей (хрящевой, фибробластической, остеобластической, недифференцированной ткани, похожей на мезенхиму, и фибробластической соединительной ткани); 4 – эпигенез остеогенной ткани, когда все виды тка- ней путем прямой метаплазии и атипической эн-хондральной оссификации и остеоидной модификации переходят в остеоидную ткань; 5 – спонгизация остеоидной ткани и образование остеонов; 6 – создание пластинчатой кости [24]. В другом варианте предлагается различать четыре стадии: пролиферацию остеобластических клеток; образование коллагеновых волокон; образование аморфного углеводно-белкового вещества; импрегнацию межклеточного вещества минеральными солями [52].

Имеются данные и о стадийности заживления переломов, основанные на конкретных морфологических преобразованиях в зоне дефекта кости: тромбирование гематомы; организация кровяного сгустка; образование фиброзного предкостного регенерата; формирование регенерата кости; образование вторичного регенерата кости; функциональная реконструкция костного регенерата [69]. Другие авторы по совокупности структурно-морфологических и биохимических изменений, происходящих в костном регенерате, выделяют следующие фазы регенерации кости: 1-я – катаболическая фаза с дезинтергацией и деградацией окружающих и входящих в состав кости структур; 2-я – прогрессирующая пролиферация и дифференцировка клеточных элементов с секрецией органической основы костного регенерата; 3-я – сложные биохимические, биофизические и физиологические процессы, приводящие к появлению первичной костной структуры; 4-я – образование пластинчатой костной структуры, обеспечивающей восстановление формы и функции кости [33]. При сопоставлении с представленными выше исследованиями оригинально выглядит вариант стадий заживления перелома кости (воспаление, фагоцитоз, фиброзная мозоль, первичная и вторичная костные мозоли), в котором авторы [80], описывая морфологию и последовательность появления разных типов клеток, недостаточно обоснованно отделили фагоцитоз от воспаления. В литературе по эмбриональному и посттравматическому остеогенезу приведены факты, показывающие, что в зависимости от характера нагрузок возможен различный характер образования костной ткани: десмальный, хондральный и ангиогенный. При первых двух типах образуются провизорные ткани, которые позже подвергаются перестройке в костную ткань, при третьем типе новообразованная костная ткань образуется непосредственно вокруг сосудов. Таким образом, высказываются разные точки зрения по поводу определения тканей, образующихся в процессе заживления костных переломов.

Вопрос о клеточных источниках регенерации костной ткани более 100 лет остается открытым. Значительное влияние на представления исследователей о регенерации костной ткани оказало учение о мезенхимном резерве полипотентных клеток взрослого организма, за счет которого происходят восстановительные процессы в тканях – производных мезенхимы (рыхлая соединительная ткань, опорные) 101

[10-12]. Одним из примеров конкретизации этого учения может служить работа [67], в которой отмечается образование остеобластов при формировании межклеточного вещества костной ткани за счет дифференцировки мезенхимальных адвентициальных клеток. В русле учения о мезенхимальном резерве и согласно камбиальной теории [22, 23] допускается и обосновывается наличие детерминированных клеточных источников остеогистогенеза.

Остеогенные клетки, поддерживающие популяцию и дифференцирующиеся в остеобласты, локализуются в трубчатой кости во внутреннем слое надкостницы, в эндосте, обнаруживаются среди клеток стромы костного мозга. Некоторые авторы утверждают, что остеобластические элементы располагаются в наружном слое надкостницы [10-12]. Есть точка зрения о рыхлой волокнистой соединительной ткани надкостницы, эндосте, каналах остеонов, являющихся продолжением тканевых элементов стромы костного мозга. Конечно, это не противоречит представлениям о соединительнотканной строме органов, в данном случае кости как органа, но очевидно и то, что подобная строма в современном понимании рассматривается не только как опорная костная структура, а, прежде всего, как сосредоточение клеток различной детерминации, разных потенций к дифференцировке, с разнообразными функциями, находящихся в кооперативных взаимоотношениях друг с другом, формирующих элемены микроокружения. Это нашло отражение в разработках методов избирательного клонирования стромальных клеток костного мозга, кариотипирования в смешанных культурах костного мозга разнолинейных мышей, иммуно-цитохимических подходов в исследованиях дифференцировки клеток гемопоэтической и соединительной тканей, в экспериментах с мутантными линиями мышей, имеющих дефект стромальных элементов и стволовых кроветворных клеток, в опытах по регуляции фенотипа остеогенных клеток, изучению дифференцировки механоцитов костного мозга, связи численности клеток костного мозга с активностью регенерации костной ткани и др. [25, 27, 34, 57, 59, 62].

Полученные результаты способствовали оформлению положения о том, что костномозговые стромальные клетки гистогенетически различны от кроветворных элементов. Многие исследователи к стромальным элементам костного мозга относят клетки, не имеющие происхождения от стволовой кроветворной клетки (ретикулярные, эндотелиоциты и другие клетки стенки синусоидных капилляров, ли-поциты и остеогенные), причем ретикулоциты и остеогенные клетки рассматриваются как стромальные механоциты [4, 71, 88]. Сложности для окончательного решения этого вопроса по-прежнему существуют, о чем свидетельствует электронно-микроскопические исследования клеточного состава эндоста мышей до и после воздействия на кроветворение циклофосфамида и эндотоксина, по результатам 102

которого авторы утверждают, что в эндосте есть общие стволовые клетки, дающие начало кроветворным и стромальным элементам [86].

Регенерационный остеогистогенез осуществляется при обязательном участии растущих кровеносных сосудов и зависит от условий васкуляризации. Зависимость интенсивности регенерации костной ткани от кровоснабжения показана в работах по исследованию переломов, резекций костей [2, 51, 56], реконструктивно-воспалительных процессов [1, 35, 42, 43], приживления хрящевых, костных трансплантатов, пересаженной надкостницы [3, 34]. Васкуляризация зон посттравматического остеогенеза способствует оксибиотическому типу обменных процессов, что создает условия [52] для дифференцировки малодифференцированных клеточных элементов в остеобласты. Внимание исследователей привлекают клетки кровеносных сосудов и элементы вокруг них, разрастающихся в зонах костеобразования. Есть точка зрения, что возможна дифференцировка эндо-телиоцитов капилляров в остеобласты [10]. На основании радиоактивных методов исследования [38, 49] установлено, что в эмбриональном остеогенезе источниками остеобластов являются периваскулярные клетки. О сложности рассматриваемого вопроса свидетельствуют работы [37, 84, 85], в которых периваскулярные клетки относятся к предшественникам хондрокластов, остеокластов, констатируется резорбция хрящевого матрикса периваскулоцитами, а также принадлежность последних к хондроцитам. Накоплены данные, что периваскулярные клетки являются камбиальными элементами в условиях заживления костного перелома, при применении дистракционного остеосинтеза [7-9, 38, 45, 54], а также при регенерации костной ткани после огнестрельного повреждения [12, 14, 15].

К элементам стенки сосудов относятся и перициты – высокодифференцированные соединительнотканные клетки, компонент стенки капилляра, венулы, артериолы [55, 63, 64]. В их цитоплазме выявлены актин и миозин, с помощью отростков осуществляется контакт периоцитов с эндотелиоцитами, регуляция тонуса сосуда. Другие авторы отождествляют их с адвентициальными клетками, периваскулярными мезенхимальными элементами, называют около-сосудистыми малодифференцированными соединительнотканными элементами, считают их во вновь образующихся сосудах источником формирования остеобластов через стадию фибробластоподобной клетки и различных клеточных форм соединительной ткани [41, 53, 81]. Разделяя точку зрения о поли-потентности околососудистых клеток и возможности их дифференцировки в клетки костной линии при способствующих тому факторах индукции, микроокружения, Р.К. Данилов и В.Г. Гололобов утверждают, что термин «перицит» целесообразно сохранить за высокодифференцированной специализированной соединительнотканной клеткой стенки сосу- дов микроциркуляторного русла. Для клеток, расположенных около сосудов и сопровождающих новообразованные сосуды, способных к дифференцировке в остеобласты, элементы соединительнотканного ряда, предпочтительней закрепить «периваскулярные». Термин «адвентициальные» не вполне корректен, так как не у всех сосудов, артериол, капилляров и венул есть сформированная адвентициальная оболочка, но есть отдельные тканевые элементы, соответствующие наружной оболочке более крупных сосудов, потому «адвентициальные» клетки в большей степени есть топографическая локализация в составе стенки сосуда [7-18].

К исследованиям по идентификации, локализации, цитогенетическим потенциям стволовой стромальной клетки, остеогенных клеток-предшественников интерес не снижается. Продолжается развитие концепции, согласно которой остеогенные клетки-предшественники присутствуют в организме в виде двух линий: детерминированные, способные к само-поддержанию и образованию костных клеток; инду-цибельные к костеобразованию клетки [58]. Детерминированные клетки для реализации своих остеогенных потенций не нуждаются в воздействии индукторов. Индуцированная кость образуется из клеток соединительнотканной природы, испытывающих действие индуктора и дефференцирующихся в костные клетки. Авторы полагают, что индуцибельные к остеогенезу клетки могут находиться в периферической крови, но нет ответа на вопрос о происхождении этих клеток или клеток-предшественников для ме-ханоцитов. Другие исследователи, изучив пролиферацию и дифференцировку скелетогенных костномозговых колониеобразующих клеток, рассматривают их как вероятные элементы в качестве стволовых стромальных клеток [59], в опытах с культивированием костного мозга человека показана возможность образования костной ткани и ее минерализации под воздействием гидрокортизона и глицерофосфата [36].

Изучены остеогенные клетки при остеогенезе в условиях напряжения растяжения [26]. Считается, что естественным внутриклеточным маркером остеогенных клеток костной ткани являются вакуолизированные митохондрии с кристаллами минерала и что эти клетки обнаруживаются не только в составе эндотелия, но и в просвете сосудов, свободно циркулируя в них. Заслуживает внимания исследование, в котором характеризуются клетки, по своим свойствам соответствующие, по мнению автора [40], сущности стволовых остеогенных клеток. В другой работе дается теоретическое обоснование замещения обширных костных дефектов биологически совместимыми материалами, заполненными костным мозгом, который рассматривается как средство доставки стволовых клеток-предшественников остеобластов [82]. Результаты используются в клинической практике, где отводится значимая роль костному мозгу, содержащему остеогенные элементы, в консолидации переломов [28].

Таким образом, не утрачивает значения предположение, что в регенерации костной ткани участвуют гетерогенные клеточные источники различной локализации, происхождения, с исходными потенциями к дифференцировке, остеогенными возможностями [31]. Однако есть другие примеры источников происхождения костного регенерата – элементы кровяного сгустка, фиброциты, гистиоциты, жировые клетки, перициты, остеокласты, клетки миелоидного ряда, эндотелиоциты. Сложно решить вопрос об участии периваскулярных клеток в посттравматической регенерации костной ткани, их цитогенетических потенциях. Требуются комплексные исследования количественной характеристики пролиферативных возможностей периваскулоцитов, сравнительного анализа показателей синтеза ДНК, митотического индекса этих элементов, остеобластов, фибробластов и хрящевых клеток, а также электронно-микроскопических данных, отражающих их дифференцировку и специализированные функции. Решение этих вопросов является очевидной необходимостью разработок, касающихся регенерации костной ткани при огнестрельных переломах.

Основная роль в восстановлении дефекта кости после перелома принадлежит элементам остеоблас-тического дифферона, особенно тем клеткам, которые активно синтезируют органическую основу костного матрикса, участвуют в ее минерализации. Но весьма значима в регенерации костной ткани роль клеток, представляющих другие по происхождению диффе-роны, например остеокласты, которые принимают участие в разрушении и ремоделяции костных структур в зоне бывшей травмы, взаимодействуя в составе регенерата с различными клеточными дифферонами.

Остеобласты – костеобразующие клетки. При остеогистогенезе синтез белкового компонента-предшественника коллагена, глюкозаминогликановых субстанций и неколлагеновых белков межклеточного вещества костной ткани связан со специфической функцией этих элементов [5, 33, 39, 44, 48]. Электронномикроскопическое изучение связывания частиц экзогенного маркера показало, что остеобласты и их предшественники обнаруживают ограниченную способность к поглощению окиси тория и ферритина по сравнению с макрофагоподобными клетками-предшественниками остеокластов [7-10].

В условиях тканевых культур выявлены возникновение коротких псевдоподий у остеобластов и их миграция на поверхность разреза кости. Считалось, что эти клетки синтезируют только коллаген I типа [10]. Есть факторы, полученные с помощью имму-нофлуоресцентного метода, свидетельствующие о возможности остеобластов синтезировать коллаген разных типов в течение определенных стадий заживления перелома кости [7-10]. Радиоавтографи-ческими и биохимическими методами исследования уточняется возможность выработки остеобластами некоторых фракций аморфного вещества – хондроитин – и кератосульфанов, 0-фосфосерин- и 0-фосфо-треонинсодержащих фосфопротеидов [8-10]. Исследователи приходят к выводу, что в культурах остеобластов большинство клеток представляют их разновидности [92]. Иммуногистохимически изучена возможность использования неколлаганового белка кости остеонектина, синтезируемого остеобластами, в качестве маркера их дифференцировки. Низкое содержание остеонектина в костях крысы может означать структурные и биофизические отличия от костей крупных млекопитающих [7-10]. Применив иммунофлуоресцентный метод, исследователи выявили в поднадкостничном остеоиде кости плодов человека тромбоспондин, синтезируемый остеобластами, способствующий прикреплению, но не распластыванию остеобластов человека. Остеокальцин считается потенциальным индикатором функции остеобластов. К вопросу о дифференцировке остеобластов имеет отношение исследование, где показано, что про-теинкиназа С обладает моделирующим действием на активность орнитиндекарбоксилазы, продукцию цАМФ в остеобластах, ее действие отличается от эффекта паратиреоидного гормона, но и не ограничивается влиянием на рецептор в цАМФ-генерируе-мой системе [10]. Степень дифференцировки остеобластов отражается на чувствительности сдвигов цитозольных ионов кальция к удалению внеклеточных ионов кальция или блокаде кальциевых каналов, что сказывается на процессах костной резорбции [73].

С помощью радиографического метода исследования и применением его для изучения формирования костной ткани было показано, что изотопная метка обнаруживается в остеобластах спустя достаточно длительное время, необходимое для дифференцировки меченых предшественников в остеобласты. Число остеобластов пополняется в развивающейся костной ткани за счет пролиферации и последующей дифференцировки преостеобластов [29, 49]. Последние снабжены рецепторами для паратиреоидного гормона в большей мере, чем зрелые остеобласты. По мнению некоторых исследователей, для дифференцированных остеобластов характерен низкий уровень пролиферации [47], другие авторы считают, что они вообще лишены такой способности [30]. Имеются сведения о том, что популяция остеобластов может пополняться предшественниками с G1-фазе митотического цикла и срок активной жизни остеобластов не зависит от количества выработанного костного матрикса [7-10]. Примечательны факты, полученные в эксперименте на белых крысах, свидетельствующие о том, что у остеобластов большеберцовой кости максимальное развитие эндоплазматической сети и ее цистерн, пик синтеза коллагена приходится на середину светового дня, у остеокластов протяженность гофрированной каемки днем в 2 раза больше, чем в ночное время [7-10]. Эти дан-104

ные коррелируют с циркадным ритмом формирования костного матрикса и отражают наличие биологического ритма резорбции костной ткани остеокластами, что соответствует положениям о временной и пространственной организации тканей [6].

Некоторые авторы различают в кости так называемые кость ограничивающие или покрывающие клетки [7-10]. Они имеют плоскую удлиненную форму, покрывают большую часть костной поверхности у взрослых особей. В них мало органелл, они находятся в тех местах кости, в которых не происходит формирования тканей и резорбции. Эти клетки соединяются друг с другом и с близлежащими остео-цитами промежуточными контактами. Предполагается, что это – потенциальные предшественники остеобластов, они могут регулировать минерализацию, выполнять барьерную функцию.

Остеоциты – результат терминальной формой дифференцировки остеобластов. Они обладают весьма длинными, контактирующими между собой отростками, расположены в массе межклеточного вещества костной ткани. Вместилища остеоцитов называют костными лакунами, но есть замечание [5], что термином «лакуна» обозначают углубления и полости в костном веществе, образовавшиеся в результате специфической деятельности остеокластов. С помощью световой и растровой электронной микроскопии на материале, взятом от человека, проведено тщательное исследование структуры стенок костных лакун, выделен ряд стадий их формирования, выявлены морфофункциональные и возрастные корреляции строения костных клеток и развивающегося матрикса костной ткани [19, 20, 21].

От костных полостей в межклеточное вещество отходят тонко разветвляющиеся канальцы, в которых находятся соприкасающиеся между собой отростки костных клеток диаметром 85-100 нм. Есть утверждения о возможном наличии между отростками межклеточных контактов типа щелевых и полу-десмосом [10]. Канальцы близлежащих костных полостей анастомозируют друг с другом. Таким образом, костные канальцы и, соответственно, расположенные в них отростки остеоцитов могут сообщаться с клеточными и тканевыми структурами в каналах остеонов, в периосте и эндосте.

В некоторых канальцах может располагаться по нескольку отростков. В канальцах межклеточного вещества многочисленные отростки костных клеток располагаются так, что между канальцем и отростком остается небольшое пространство, где может циркулировать внеклеточная жидкость, способствуя обменным процессам в кости. В нем иногда содержится немного фибриллярного материала в виде тонких неминерализованных коллагеновых волокон. Край костной полости приближенно соответствует форме замурованного остеоцита. В цитоплазме остео-цитов обнаруживается умеренно развитые эндоплазматическая сеть гранулярного типа, комплекс Гольд- жи, отдельные митохондрии и свободные рибосомы, но ультраструктура и функциональная активность этих клеток зависят от стадии их жизненного цикла, действия на организм животных экзо- и эндогенных факторов (паратиреоидэктомия, иммобилизация, моделирование патологии, специальный рацион питания и др.) [10]. Отмечено падение с возрастом процента зрелых остеоцитов.

Считается, что остеоциты не обладают способностью к пролиферации и трансформации. Но есть суждения, что остеоциты являются лишь стадией в развитии единой костной клетки на пути остеобласт– остеоцит–остеокласт [10]. Наиболее устоявшаяся точка зрения свидетельствует о том, что остеоциты выполняют функцию обеспечения целостности костного матрикса за счет определенного участия в образовании белкового и полисахаридного компонентов межклеточного вещества и стабилизации его минерального состава, а также обменно-транспортных процессах и, вероятно, в перициллюлярной резорбции костного материала [21, 78].

Остеокласты – крупные многоядерные клетки, которые обнаруживаются в местах резорбции костной ткани, активно участвующие совместно с остеобластами в процессах моделирования и ремоделяции в эмбриональном, постнатальном и посттравматическом остеогенезе. Характерными ультраструктурны-ми признаками для этих элементов являются наличие многочисленных цитоплазматических выростов (щеточная или гафрированная каемка), обращенных в сторону резорбируемого участка кости, выраженного количества мембранных пузырьков и вакуолей разных размеров, значительного числа митохондрий, слабо развитых структур гладкой и гранулярной эндоплазматической сети с зональным распределением [75, 89]. Особое значение придается так называемой светлой зоне остеокластов, которая, возможно, и представляет собой барьер, контролирующий состав резорбируемой микросреды. Избирательность такого барьера очень высока: в этот компартмент транспортируются при участии рецепторов и секретируются ферменты, резорбирующие компоненты костного матрикса [76]. Показано, что рекомбинантный макрофагальный колониестимулирующий фактор является ингибитором резорбции [96], а женские половые гормоны стимулируют этот процесс остеокластами [68]. Иммунофлуоресцентные методы исследования в цитоплазме остеокластов выявили актин в виде кольца с гладкими контурами. Зона локализации актина соответствует светлым зонам, авторам удалось установить связь между светлыми зонами и контурами лакун резорбции. Установлен функциональный антиген остеокластов, участвующий в регуляции костной резорбции [87]. Ряд исследователей уточнили ферментный состав в различных структурах остеокластов, обнаружив при этом активность нейтральной пирофосфатазы, неспецифической эстеразы типа В, протеиназ и др. [77, 93], и показатели возмож- ного внеклеточного переваривания коллагена в микроокружении остеокластов.

Многие авторы считают, что моноциты, макрофаги и остеокласты имеют общее происхождение и объединяются в единую фагоцитарную систему [72, 90], но есть мнения о происхождении этих элементов их клеток сосудистой стенки [7-10]. Поскольку нейраминовая кислота, замещающая гликопротеины, синтезируется как остеокластами, так и гигантскими гистиоцитами, то это свидетельствует об общности происхождения этих клеток. Есть доказательная точка зрения, что у остеокластов, моноцитов и макрофагов имеются разные клетки-предшественники, образующиеся из стволовой кроветворной клетки, она основывается на данных о различиях у остеокластов, моноцитов и макрофагов в рецепторах клеточной поверхности, антигенных детерминантах, ферментативной активности, цитохимических маркерах, а также функциональном ответе на гормоны и цитокины. Предшественники остеобластов в виде мононуклеар-ных клеток достигают участков резорбции через кровоток, сливаются и дают начало остекластам [83].

Таким образом, в литературе нет единого мнения о способности остеобластов к пролиферации, высказываются суждения о реальности дифференцировки остеобластов в остеокласты. В связи с этим перспективно продолжение исследований пролиферативных возможностей остеобластов, поскольку они – ключевой фактор в оценке регенераторных свойств костной ткани. Поэтому изучение посттравматического остеогистогенеза с позиций клеточно-дифферонной организации тканей представляется перспективным для решения ряда задач в военно-полевой хирургии, травматологии и ортопедии.