Применение биохимических маркеров для ранней диагностики и предупреждения смещения сычуга у молочных коров

Экономический ущерб смещения сычуга у коров связан со снижением молочной продуктивности, увеличением затрат на ветеринарное обслуживание и лечение сопутствующего кетоза. Своевременное выявление заболевания позволяет снизить риск уменьшения удоев и выбраковки коров из стада, что помогает предотвратить финансовые потери для владельцев скота [5].

Исследования показывают, что смещение сычуга в брюшной полости у коров происходили в начальный период лактации вследствие влияния плода в матке на расположение сычуга, выдавливая его со дна брюшной полости. При соблюдении нормальных условий кормления и содержания, частота заболевания находится на уровне менее 1%. Однако, при несоблюдении рационов кормления, могла превышать 5%. По этиологии болезнь напоминает атонию сычуга [5], при которой прекращались его сокращения, что приводило к потере аппетита, отказу от корма и вздутию брюшной полости [3, 6, 7]. Биохимические исследования крови показали повышение содержания бетагидроксимасляной кислоты и ацетона на фоне снижения концентрации апополипротеина В100, что в дальнейшем вызывало у коров жировую дистрофию печени.

Позднее выявление смещения сычуга по фенотипу приводит к ухудшению обмена веществ и необходимости оперативного вмешательства. Это, в свою очередь, изменяет сроки хозяйственного использования коров и ухода от содержания за ними. Оперативное вмешательство более эффективно на более ранних сроках. Изменение биохимических показателей крови происходит раньше проявления клинических признаков. Поэтому внедрение и апробирование методов ранней инструментальной диагностики, в т.ч. биохимическими методами, в настоящее время, является актуальным вопросом и требует разработки и внедрения методологии экспресс-тестирования для раннего выявления смещения сычуга у новотельных коров [3].

Целью работы была апробация методологического подхода биохимической диагностики смещения сычуга и связанных с этих нарушений обмена веществ у молочного скота с использованием современного и высокоточного оборудования для биохимического анализа. Задачами исследования являлось измерение гематологических и биохимических показателей крови животных при смещении сычуга и в норме, и выявление коров с возможностью возникновения сопутствующих нарушений обмена веществ.

Условия, материалы и методы. Работа выполнена в рамках сотрудничества племенной организации «Московское по племенной работе» в Московской государственной ветеринарной академии им. К.И. Скрябина и Отдела генетики сельскохозяйственных животных ФГБНУ Всероссийского государственного научно-исследовательского института племенного дела Минсельхоза России. Биологическими объектами исследования были племенные новотельные коровы голштинской породы (n=46), с следующей продуктивностью: удой 7146-8630 кг/305 дн. 1-2 лактации, с содержанием жира в молоке 4,10-4,15%. В исследовании количество коров, которые находились в нормальном состоянии составило 12 голов, с патологией (с симптомами смещения сычуга) 34 головы.

По ранее предложенным рекомендациям [3] проведены исследования по диагностике смещения сычуга (далее «смещения»), основанные на принципах ветеринарной диспансеризации по состоянию новотельных коров. Отбор здоровых и животных со смещением сычуга проводили в ходе клинического наблюдения за стадом, фиксируя изменения частоты дыхания и пульса, температуры тела, а также результаты перкуссии и аускультации грудной клетки. Для дальнейшего анализа сформировали две группы животных: 1 группа - с левосторонним «Л» (n=25), 2 группа - с правосторонним «П» (n=9) смещением сычуга.

В качестве биоиндикаторов использовали автоматизированный сбор биохимических показателей обмена веществ и кетозных нарушений в сыворотке крови без антикоагулянта. Исследование проводили с помощью автоматизированного биохимического анализатора крови и коммерческих наборов реагентов HemWell 2910 (США) с соблюдением рекомендаций производителя и ГОСТ ИСО/МЭК 17025 (2019).

Концентрацию гамма-глутамилтранс-феразы (гамма-глютамилтранспептидаза, GGT, GGTP, ГГТ, ГГТП, КФ 2.3.2.2., CAS

9046-27-9) измеряли в ед. акт./л. Концентрации аспартатаминотрансферазы (глутамат ок-салоацетат-трансаминазы, АСТ, АсАт, КФ 2.6.1.1, CAS 9000-97-9) и аланинаминотрансферазы (АлАТ, АЛТ, КФ 2.6.1.2, CAS 9000-866) измеряли в ед. акт./л. Количество бета-гидроксимасляной кислоты ( в -гидроксибутирата, в-оксимасляной кислоты, БОМК, СН₃СН(ОН)СН₂СООН, CAS 300-85-6) измеряли в г/моль. Концентрацию лактата (молочной кислоты, 2-гидроксипропановой кислоты, CH₃CH(OH)COOH, CAS 50-21-5) определяли в ммоль/л. Концентрацию мочевины (диамида угольной кислоты, CH 4 N 2 O, CAS 57-13-16) наблюдали в пмоль/л. Инсулин (MW 5733.49, C 254 H 377 N 65 O 75 S 6 , CAS 11070-73-8) измерялся в качестве дополнительного маркера состояния поджелудочной железы. Для оценки деградации жирных кислот в печени оценивали количество неэтерифицированных жирных кислот в мкМ и связывали с измерением холестерина и липопротеинов. Концентрацию глюкозы (D-глюкозы, моносахарида, декстрозы, гексозы, C 6 H 12 O 6 , CAS 50-99-7) измеряли в ммоль/л. Щелочную фосфатазу (ЩФ, ALP, ALKP, КФ 3.1.3.1, CAS 9001-78-9) измеряли в ед. акт./л. Креатинин (1-метилгликоциамидин, C₄H₇N₃O, CAS 60-27-5) измеряли в мкмоль/л. Общий белок измеряли в г/л.

Статистический анализ полученных данных проводился в программном обеспечении R (пакет OfficialStatistics на R_CRAN). Уровень значимости был установлен на р<0,05, при вычислении средних значений и стандартных ошибок. Величины нормы и патологии существенно отличались на значимую величину, в том случае, если различие было больше статистической ошибки измерения.

Результаты и обсуждение. Для выявления изменений сычуга проведен анализ биохимических параметров крови животных, где было показано, что концентрация метаболитов у коров достоверно различна (табл. 1, 2).

Из таблицы 1 видно, что величина коэффициента вариации была высокой при измерении мочевины, глюкозы, кальция, фосфора и щелочной фосфатазы, что свидетельствовало о низкой информативности данных параметров при поиске пограничных состояний новотельных коров. Для определения нормы и патологии биохимических показателей в результате исследований выделили параметры, которые значимо отличались в состоянии смещения сычуга от нормы, а также имели небольшой коэффициент вариации, достаточный, чтобы различать типы смещения - «Л» и «П» смещения (табл. 1).

Анализ биохимических показателей выявил статистически значимые различия между группами. В контрольной группе следующие значения: бета-гидроксимасляная кислота — 0,25±0,52 г/моль, лактат — 1,8±0,71 ммоль/л, инсулин — 7,9± 1,20 пмоль/л, мочевина — 3,15±1,58 пмоль/л.

Таблица 1 – Биохимические индикаторы зависимости от смещения сычуга у высокопродуктивных коров в ранний послеродовой период

Измеряемые значения	Норма «Н» (n=12)	«Л» (n=25)	«П» (n=9)	Разница между группами (t,A/ достоверность)
				Н-Л	Н-П	Л-П
Бета-гидрокси-масляная кислота, г/моль	0,25±0,52	1,8±0,36	0,15±0,60	2,45, +1,55/ 0,05*	0,19,00,1/ -	2,36, -1,65/ 0,02*
Лактат, ммоль/л	1,8±0,71	2,45±0,49	4,25±0,82	0,75, +0,65/ -	2,26, +2,45/ 0,04*	1,88, +1,8/ -
Инсулин, пмоль/л	7,9±1,20	12,15±0,83	10,2±1,38	2,91, +4,25/ 0,006*	1,26, +2,3/ -	1,26, -1,95/ -
Мочевина, пмоль/л	3,15±1,58	8,1±1,09	7,9±1,83	2,58, +4,95/ 0,01*	1,96, +4,75/ -	0,09, -0,2/ -
Гамма глутамил -трансфераза, ед/л	36,1±14,41	54,2±9,98	86,4±16,64	1,03/ +18,1/ -	2,29, +50,3/ 0,03*	1,66, +32,2/ -
Глюкоза, мг/дл	55,9±20,02	79,5±13,87	125,5±23,12	0,97, +23,6/-	2,28, +69,6/ 0,03*	1,70, +46,0/ -
Аспартатаминотрансфераза, ед/л	80,5±25,35	152,1±17,56	163±29,28	2,32, +71,6/ 0,03*	2,13, +82,5/ +0,05*	0,32, +10,9/ -
Неэтерфици-рованные жирные кислоты, мкМ	79,7±13,28	123,5±9,20	116,3±15,34	2,71, 43,8/ 0,01*	1,8, +36,6/ 0,09*	0,40, -7,2/ -

Примечание: * - р<0,05

В «Л» (n=25) отмечено существенное повышение показателей: бета-гидроксимасляная кислота — 1,8±0,36 г/моль, лактат — 2,45±0,49 ммоль/л, инсулин — 12,15± 0,83 пмоль/л, мочевина — 8,1±1,09 пмоль/л. Для «П» (n=9) следующие отклонения: снижение бета-гидроксимасляной кислоты до 0,15±0,60 г/моль, максимальный уровень лактата — 4,25±0,82 ммоль/л, гипергликемия — 125,5±23,12 мг/дл, повышение гамма-глутамилтрансферазы до 86,4±16,64 ед/л, повышение АсТ — 163±29,28 ед/л (табл. 1).

Выявлены статистически значимые повышение уровня НЭЖК в обоих экспериментальных группах животных, увеличение гамма-глутамилтрансферазы в группе «П», гипергликемия «П», повышение АСТ во всех группах относительно контроля. Представленные в табл. 1 результаты свидетельствуют о нарушении метаболического статуса в «Л» и «П», особенно выраженном в группе «П».

Определение пороговых значений размещения сычуга у коров после отела является необходимым условием стандартизации диагностики и лечения данного патологического состояния, а статистическая значимость результатов помогает подтвердить достоверность установленных показателей (табл. 2).

При исследовании биохимических показателей крови у новотельных коров выявлены существенные различия в метаболических процессах при разных типах смещения сычуга. В ходе исследования инструментально были определены биохимические показатели крови общий белок, активность аспартатаминотрансферазы (АСТ) и гамма-глутамилтрансферазы (ГГТ), содержание кальция, фосфора, глюкозы, альбумина и других метаболитов [3, 8], с внедрением экспресс-диагностических алгоритмов для ускорения и автоматизации тестирования [3].

В ходе биохимического исследования крови выявлен уровень мочевины составил 3,9 пмоль/л при диапазоне колебаний от 1,75 до 5,4 пмоль/л. Концентрация глюкозы находилась в пределах 4,15 ммоль/л (2,45 – 5,95 ммоль/л). При оценке минерального обмена выявлены содержание кальция — 10,1 мг% (8,45– 12,42 мг%), концентрация фосфора — 8,1 мг% (4,9-11,95 мг%).

Таблица 2 - Определение пороговых значений по состоянию размещения сычуга у коров после отела (р<0,05)

Измеряемые значения	Среднее	Мин	Макс	CV
1	2	3	4	5
Мочевина, пмоль, л	3,9	1,75	5,4	14,95
Глюкоза, ммоль/л	4,15	2,45	5,95	15,98
Кальций, мг%	10,1	8,45	12,42	18,1
Фосфор, мг%	8,1	4,9	11,95	16,32
Креатинин, мкмоль/л	97,5	35,4	145,2	182,4
Холестерин, мг%	158,7	95,3	198,3	20,2
АСТ, ед/мл	155,4	120,1	242,1	19,5
АЛТ, ед/мл	140,1	20,4	195	30,4
Общий белок, г/л	33,2	35,3	42,8	11,2
ЩФ, ед/л	720,5	390,1	1045	32,5

Значительные отклонения зафиксированы по показателям креатинина — 97,5 мкмоль/л (35,4–145,2 мкмоль/л) и холестерина — 158,7 мг% (95,3–198,3 мг%). Анализ ферментативной активности показал активность АСТ составила 155,4 ед/мл (120,1–242,1 ед/мл), активность АЛТ — 140,1 ед/мл (20,4 – 195 ед/мл). Выявленная высокая гетерогенность выборки, особенно по показателям креатинина и АЛТ, свидетельствует о неоднородности исследуемой группы. Повышенные значения АСТ и АЛТ указывают на вероятные нарушения функциональной активности печени (табл. 2).

Установлено, что концентрация бета-гидроксимасляной кислоты демонстрирует противоположную динамику при левостороннем «Л» и правостороннем «П» смещении, что указывает на различный риск развития кетозного состояния. При этом уровень лактата в обоих случаях превышает нормативные показатели, не демонстрируя значимых различий между группами.

Выявлено значимое повышение концентрации мочевины и инсулина относительно нормы при обоих типах смещения. Примечательно, что уровни инсулина различаются между группами, тогда как показатели мочевины остаются сопоставимыми. Концентрация глюкозы в крови при патологическом состоянии превышает норму, причём выраженность отклонений зависит от типа смещения сычуга. Аналогичная картина наблюдается с неэтери-фицированными жирными кислотами, уровень которых повышен при обоих типах патологии без значимых межгрупповых различий.

При левостороннем смещении «Л» регистрируются значимые отклонения от нормы по ряду показателей: бета-гидроксимасляной кислоте, инсулину, мочевине, аспартатаминотрансферазе и неэтерифицированным жирным кислотам. При правостороннем смещении «П» достоверные отличия от нормы наблюдаются только по уровню лактата, при этом отсутствуют значимые изменения по гамма-глутамилтрансферазе и глюкозе в сравнении с левосторонним «Л» типом смещения.

Между группами с различным типом смещения достоверные различия выявлены исключительно по уровню бета-гидроксимасляной кислоты, в то время как остальные исследуемые параметры не демонстрируют статистически значимых межгрупповых отличий (табл. 1).

У других исследователей при анализе установлено, что концентрация ГГТ существенно возрастала при правостороннем «П» смещении сычуга, что может свидетельствовать о нарушениях функции печени [9]. Активность АСТ повышалась при обоих типах смещения, указывая на повреждение тканей [3].

Исследование уровня бета-гидроксимасляной кислоты (БОМК) ранее также показало разнонаправленную динамику при различных типах смещения, что отражает риск развития кетоза. Концентрация лактата превышала нормативные значения при обоих типах патологии, нарушая кислотно-основное состояние [10].

Показатели мочевины и инсулина, как правило, значительно превышали референсные значения, свидетельствуя о нарушениях белкового обмена [11]. Уровень мочевины отражал эффективность конверсии протеина в кормах [12]. При высокобелковом кормлении и внесении большого количества азотных удобрений в почву пастбищ может наблюдаться увеличение содержания мочевины и снижение продуктивности животных, поскольку мочевина способствует понижению кислотности молока и подавляет кислотообразующую способность желудочно-кишечного тракта [12, 13].

В ходе исследования также анализировали показатели липидного обмена, включая уровень апополипротеина B, являющегося маркером деградации липопротеинов низкой плотности в печени [13]. Апополипопротеин B

(апоB, ген apoB, Genbank NM_000384, UniProt P04114) представляет собой пример маркера липопротеинов низкой плотности (ЛПНП)). Молекула ApoB является ключевым маркером деградации ЛПНП в печени и является одним из лучших индикаторов атеросклероза, нарушений работы печени и сердечно-сосудистой системы коров. Изоформы АпоВ (48, 2152 а.о., 241 кДа и 100, 4536 а.о., 512 кДа) гидрофобны и практически полностью погружены в слой липидов клетки [14, 15].

Уровень щелочной фосфатазы (ЩФ) при одновременном изменении маркеров кальция и фосфора указывал на возможные повреждения печени, почек и деминерализацию костной ткани. Этот параметр отражал уровень энергетического обмена и полноценность кормового рациона [16, 17, 18].

Креатинин, отражающий энергетический обмен и полноценность кормового рациона, оказался недостаточно информативным показателем, так как его величина в наблюдаемых группах оставалась стабильной [19].

Измерение общего белка позволило оценить состояние почек, эндокринной системы и обмена веществ животных в период начала лактации [20].

Определение границ нормы и отклонений в анализах крови коров очень важно по нескольким причинам. Во-первых, это помогает вовремя заметить проблемы со здоровьем животных, ещё до появления явных признаков болезни. Например, можно заранее обнаружить смещение сычуга. Во-вторых, зная эти границы, а также вариансу, ветеринары могут точнее оценивать состояние каждой коровы и принимать правильные решения по лечению. Это особенно важно в первые недели после отёла, когда животные наиболее уязвимы. В-третьих, контроль показателей крови позволяет следить за обменом веществ у коров. Если какие-то значения выходят за пределы нормы, это может говорить о проблемах с кормлением или развитии скрытых заболеваний.

Клинические проявления патологии сычуга характеризовались комплексом нарушений: снижением общей активности животных, потерей аппетита, падением молочной продуктивности. У больных коров отмечались признаки кетоза, изменение характера фекальных масс и деформация левой части брюшной стенки. Термометрия показала отсутствие гипертермии (температура<39 °C), однако регистрировалось повышение частоты сердечных сокращений (>61 удара в минуту) и дыхательных движений (>22 в минуту). При левостороннем «Л» смещении выявлялись дополнительные патологические состояния: системные реакции организма, маститы, метриты и задержка отделения последа [21].

При обследовании (аускультация и перкуссия) у животных с левосторонним смещением определялись характерные высокочастотные резонирующие звуки в левой дорсальной области. Пальпация прямой кишки выявляла смещение рубца к срединной линии.

Патогенетические механизмы при кетозе включали переключение метаболизма на утилизацию кетоновых тел вместо глюкозы, что характерно для состояний энергетического дефицита. При смещении сычуга происходило его дислокация: влево - под центральный отдел рубца, вправо - в межорганное пространство между правой брюшной стенкой и кишечником, что приводило к нарушению эвакуации газов и нарушению кровоснабжения органа [3].

Полученные клинические данные в сочетании с биохимическим профилем крови позволили сформировать комплексную картину патологических изменений при различных типах смещения сычуга.

Применение методов сетевой биологии в обработке больших данных позволяет автоматизировать интерпретацию результатов, связанных с патологическими состояниями, что способствует более раннему выявлению аномальных процессов у новотельных коров при развитии смещения сычуга. Применение методов сетевой биологии в обработке больших данных позволяет автоматизировать интерпретацию результатов, связанных с патологическими состояниями, что способствует более раннему выявлению аномальных процессов у новотельных коров при развитии смещения сычуга [2, 22].

Для аттестованных лабораторий системы Минсельхоза России рекомендуется включение в протокол исследования биохимических показателей определения концентрации апо-полипопротеина B100 как дополнительного критерия оценки метаболического статуса.

В рамках развития эффективного животноводства и внедрения инновационных технологий целесообразно внедрение методологии автоматизированного биохимического анализа крови.

Развитие высокопродуктивного скотоводства в России требует повышения квалификации специалистов в области современных методических и технологических решений. Систематический сбор метаданных по биохимическим показателям, фенотипическим признакам и клиническим случаям на национальном уровне позволит масштабировать исследования от ограниченного числа объектов к массовому обследованию животных. Это обеспечит возможность ранней диагностики патологических состояний и своевременного принятия организационных и ветеринарных мер по сохранению здоровья поголовья.

Выводы . В ходе исследования установлены ключевые биохимические показатели крови новотельных коров, значимые для ранней диагностики смещения сычуга и метаболических нарушений. К ним отнесены - ферменты: гамма-глутамилтрансфераза, аспартатаминотрансфераза, аланинаминотрансфераза; метаболические маркеры: бета-гидроксимасляная кислота, лактат, мочевина, инсулин, глюкоза;

липидный профиль: липопротеины низкой плотности.

На основании проведённого анализа определены пороговые значения данных показателей как в физиологической норме, так и при патологических состояниях. Установлены референсные интервалы, включающие максимальные, минимальные и средние значения параметров крови, что позволило количественно оценить предельные отклонения при различных состояниях животных.

Выявлено, что определение концентрации мочевины в крови и молоке может служить дополнительным критерием для оценки сбалансированности рационов кормления.

Эффективность диагностики подтверждена применением инновационных аналитических методов, что обосновывает необходимость модернизации лабораторного оборудования в соответствии с международными стандартами качества (ГОСТ ИСО 17025).

Результаты исследования создают научную основу для совершенствования системы ранней диагностики смещения сычуга и сопутствующих метаболических нарушений у новотельных коров, что имеет существенное значение для развития современного молочного животноводства.