Применение флуоресцентного метода для контроля качества молока

Флуоресцентная спектроскопия является важнейшим инструментом при изучении сложных молекулярных объектов и систем, включая молочные продукты, биологические мембраны, протеины, ДНК и др. Этот экспериментальный метод позволяет получать детальную информацию о структуре и динамических свойствах молекулярных систем. Ключевым моментом успешного применения флуоресцентной спектроскопии является адекватный анализ получаемых экспериментальных данных.

Методы флуоресцентной спектроскопии широко применяются в биофизических, медицинских и химических исследованиях. Причиной этого служат присущая этим методам высокая чувствительность, а также удобный временной диапазон: испускание флуоресценции происходит через 10 нс после поглощения света. За этот промежуток времени может произойти множество различных молекулярных процессов, которые способны повлиять на спектральные характеристики флуоресцирующего соединения. Такое сочетание чувствительности с подходящим временным диапазоном способствует тому, что флуоресцентные методы обычно используют для изучения биологических препаратов [1].

В качестве исследуемых объектов нами были выбраны молочные продукты с различной массовой долей жирности, которые указаны в таблице 1.

Таблица 1. Исследуемые молочные продукты

Продукт         Массовая доля жира № образца

Пахта	0,1-0,7%	1(контрольный)
Молоко	1,5%	2
Молоко	2,5%	3
Молоко	3,2%	4
Молоко отборное	4%	5

Для анализа исследуемых веществ, нами была использована спектральная установка с применением схем «на отражение» (рис. 1). Наиболее эффективным для решения такого рода задачи оказалось использование четвертой гармоники (266 нм) импульсно-периодического лазера YAG , генерирующего коротковолновое ультрафиолетовое излучение со средней мощностью 10 мВт при частоте следования наносекундных импульсов генерации 5–10 кГц. В схеме “на отражение” полезный сигнал собирается из канала с веществом практически из той же точки, из которой выходит возбуждающее излучение из смежного световода. Преимуществом данного метода является сильное ослабление возбуждающего излучения, проходящего “вперед”, в то время как вторичное излучение собирается вторым световодом “назад”.

1 1064нм

532нм

266нм

Рисунок 1. Схема экспериментальной установки для анализа малых количеств веществ «на отражение»: 1,2,7 – зеркала; 3 – активный элемент; 4 – накачка; 5 – нелинейный кристалл; 6 – линза; 8 – конденсатор;

9 – фиксатор световода; 10,11 – световод; 12 – спектрограф; 13 – зонд; 14 – измеряемый образец;

15 – компьютер.

Для возбуждения и регистрации спектров флуоресценции использовалась волоконно-оптическая методика (см. работы [2-4]). Схема используемой экспериментальной установки приведена на рис. 1. При этом в качестве источника возбуждающего ультрафиолетового излучения использовалась четвертая гармоника(266 нм) лазера на алюмоиттриевом гранате, генерирующего импульсно-периодическое излучение с длиной волны 1064 нм. Средняя мощность возбуждающего ультрафиолетового излучения на поверхности анализируемого препарата составляла 10 мВт, что позволяло осуществлять анализ объекта без какой-либо его деструкции. Небольшое количество анализируемого вещества помещалось в кювету (14) (см. рис. 1).

Кварцевые световоды (10,11) использовались для подведения ультрафиолетового излучения к веществу и для отведения, возникающего в анализируемой пробе флуоресцентного излучения к малогабаритному спектрографу (12) типа FSD8. При этом пространственное разрешение на поверхности анализируемой пробы составляло 0,1мм. Используемый тип малогабаритного спектрографа позволял осуществлять регистрацию спектров флуоресценции исследуемых молочных продуктов в диапазоне 200 – 1200 нм при экспозициях 0,01-0,1с. От миниспектрометра цифровая информация о спектре вторичного излучения передавалась на компьютер. После компьютерной обработки нами были построены нормированные спектры флу- оресценции молочных продуктов.

Для установления количественного отличия флуоресцентных спектров, полученных от молочных продуктов с различной жирностью, нами были построены корреляционные функции с использованием следующего соотношения:

K X^A ( λ ) = 1 - | i X ( λ ) - i A ( λ )|

i ( λ ), i ( λ )|

Здесь ^XА - нормированные спектры флуоресценции анализируемого препарата (х) и пахты (А). Соответствующие спектры приведены на рис. 2. Корреляционные спектры строились в диапазоне длин волн ^∆ λ ^{= 369 - 468} нм с интервалом разбиения ^{∆ λ i = 0,26} нм. Кроме того, были вычислены соответствующие коэффициенты корреляции анализируемых препаратов по отношению к пахте по формуле:

i = N

K X = N ' K X ^

.

Близость вида спектров флуоресценции молока с различным процентным содержанием жира и пахты обусловлена присутствием в них одного и того же ком-

понента.

Интенсивность, отн.ед1,00-1                /

200 300 400 500 600 700 800 900 Х’ пт

Рисунок 2. Флуоресцентные спектры молочных продуктов (1 – пахта; 2 – молоко с жирностью 1,5 %; 3 – молоко с жирностью 2,5 %; 4 – молоко с жирностью 3,2 %; 5 – молоко отборное с жирностью 4,0 %; * вторая и третья гармоники лазерного излучения)

В таблице 2 приводятся коэффициенты корреляции молочных продуктов с разной долей жира. Нами установлено, что коэффициенты корреляции исследуемых молочных продуктов каждой исследуемой массовой доле жира различны.

Таблица 2. Коэффициенты корреляции молочных продуктов

Название продукта	№ образца	Коэффициент корреляции
Пахта	1	эталон
Молоко	2	0,26
Молоко	3	0,38
Молоко	4	0,57
Молоко отборное	5	0,73

* - № образца в данной таблице соответствуют номерам в таблице 1.

Таким образом, разработанный нами метод позволяет неразрушающим способом по флуоресцентным спектрам контролировать молекулярный состав и струк- туры молочных продуктов. Возбуждение спектров флуоресценции осуществлялось четвертой гармоникой лазера на алюмоиттриевом гранате с использованием волоконно-оптического зонда и малогабаритного светосильного спектрографа.

Построены корреляционные спектры флуоресценции, позволяющие устанавливать различия в составе и структуре даже при близости вида их спектров флуоресценции. Обнаружено, что коэффициенты корреляции исследуемых молочных продуктов каждой исследуемой массовой долей жира различны. В связи с этим, предложенная нами методика позволяет также идентифицировать молочные продукты по процентному содержанию жира.

Разработанный метод может быть использован не только для контроля качества молока, но и фармацевтических препаратов, и для большого класса биоактивных структур, люминесцирующих под действием ультрафиолетового излучения.