Протеолиз белковых компонентов растительного сырья с высоким аллергенным потенциалом

Введение. В последнее время распространенность целиакии приобретает значительные масштабы. Это одно из немногих наследственных заболеваний, которое значительно снижает качество жизни. Для снижения рецидивов и увеличения длительности ремиссии разработка программ диагностики и назначение безглюте-новой диеты крайне актуально [1]. Значимость рационов безглютенового питания с составленными рецептурами необходимо законодательно утвердить, поскольку от этого зависит здоровье и качество жизни больных целиакией [2, 3].

В литературе имеется множество публикаций по модификации глютена, приводящей к снижению его аллергенных свойств [4–6]. Есть сведения по снижению аллергенности до низкомолекулярных пептидов и аминокислот растительными, животными, микробными пептидазами [7–12]. Применение пептидаз из пророщенного зерна, пепсина или трипсина, микробных пептидаз на основе Aspergillus, молочнокислых бактерий имеет возможность получения низко-глютеновых продуктов с содержанием глютена от 20 до 100 мг/кг [13–15].

Грибы рода Aspergillus – чрезвычайно разнообразная и метаболически гибкая группа мик-ромицетов. У семи различных видов рода Aspergillus (A. nidulans, A. niger, A. oryzae, A. terreus, A. flavus, N. fischeri и A. fumigatus) идентифицированы 133 возможные пептидазы [16]. По ре- зультатам сравнения геномов в грибах рода Aspergillus составляют гены, кодирующие сериновые пептидазы. Проведенные исследования биокаталитических активностей ферментов подтверждают эти результаты, так как сериновые пептидазы действительно представляют наиболее крупный класс протеолитических ферментов [17, 18].

Среди пептидаз грибного происхождения пептидаза из Aspergillus niger (AN-PEP) очень эффективно разрушает белки и пептиды глютена [16–18]. Представленный фермент оптимально работает при нейтральном рН, остается стабильным при кислом и полностью устойчив к перевариванию пепсином. Он разрушает неповрежденные белки глютена, а также стимулирующие Т-клетки пептиды гораздо быстрее, чем микробные пептидазы на основе бактериальных культур. Еще одним преимуществом является то, что некоторые штаммы рода Aspergillus являются непатогенными, и ферменты на их основе могут быть произведены с невысокими затратами в промышленных условиях. Также известно, что пептидазы из Aspergillus oryzae (в основном дипептидилпептидаза IV) способны детоксифицировать достаточное количество глютена [19, 20].

Но очевидно, что до сих пор существует актуальность разработки новых методик снижения глютеновых фрагментов и получения продуктов на их основе. Одним из эффективных методов является метод биокаталитической деградации глютена [21–23].

Цель исследования – изучение возможностей использования протеиназ грибного происхождения для блокирования механизмов возникновения и развития целиакии путем гидролиза глютеновых белков, являющихся основой развития данного заболевания.

Объекты и методы . В качестве объектов исследований были использованы мука и экструдат пшеницы из цельнозерновой муки. Для проведения гидролиза муки и экструдата были использованы ферментные препараты: КФПА (комплексный ферментный препарат Амилопро-тооризин) и ферментные препараты, содержащие ферменты амилолитического и протеолитического действия. Уровень протеолитической активности анализировали по степени гидролиза гемоглобина [24], амилолитической и глюкоамилазной – по степени гидролиза крахмала

[25], ксиланазной – по степени гидролиза ксила-на [26], целлюлазной – по степени гидролиза карбоксиметилцеллюлозы [27]. Cостав и концентрацию свободных аминокислот определяли на высокоэффективном жидкостном хроматографе фирмы KNAUER (Германия) [28].

Процесс гидролиза высокомолекулярных полимеров белковых веществ осуществляли ФП в подобранных ранее условиях: в течение 2 ч при 50 °С, при рН 5,5 [14], гидромодуль суспензии 1:2. Для исследования белковых фракций фер-ментолизатов и исходного сырья использовали метод ДДС-электрофореза в полиакриламидном геле [29]. Статистическую обработку экспериментальных данных проводили методом однофакторного дисперсионного анализа с помощью компьютерной программы Excel.

Результаты и их обсуждение . Как известно, для гидролиза пшеницы необходимо осуществить подбор ферментов или ферментных систем для максимальной деструкции высокомолекулярных белков до низкомолекулярных пептидов и свободных аминокислот.

На первом этапе исследований изучали состав ферментов, входящих в состав ферментного комплекса.

В таблице 1 в качестве ферментов для гидролиза глютена использовали ферментные препараты протеолитического и амилолитического действия (ФС), включающие ферментные препараты: ФП Flavourzyme, содержащий две аминопептидазы, две дипептидилпептидазы, три эндопептидазы; ФП Neutrase, содержащий нейтральную протеазу; ФП Fyngamyl, содержащий альфа-амилазу производства компании Novozymes. В качестве сравнения с импортными аналогами использовали ферментный препарат отечественного производства КФПА, содержащий в своем составе ферменты аминопептидазу, эндопептидазу, нейтральную протеазу и альфа-амилазу для гидролиза белковых и крахмалистых веществ зернового сырья.

Далее исследовали ФП КФПА и комплекс ферментов Flavourzyme + Neutrase + Fyngamyl на степень гидролиза полимеров белковых веществ. Для этого был проведен электрофорез в ПААГ с маркером от 14,4 до 97,4 кДа. Объектами служили прогидролизованные цельнозерновая пшеничная мука и экструдат,полученный на основе этой муки.

Таблица 1

Ферментный препарат Продуцент Состав ферментного комплекса,ед/г (ед/см3) ПС АС ГлС КС ЦС КФПА (комплексный ферментный препарат Амилопротооризин) Aspergillus oryzae 600+29,5 800+39,5 0 50+2,3 0 Протоферм FP Aspergillus niger 900+43,0 0 0 0 0 Flavourzyme Aspergillus oryzae 500+22,8 0 0 0 0 Брюзайм Aspergillus niger 0 0 0 1000+48,5 1100+52,3 Термамил Bacillus subtiliis 0 900+45,0 200+10,5 0 0 кДа

Характеристика используемых ферментных препаратов

97,4

75,0

50,0

37,0

31,0

20,0

14,4

ДДС-электрофорез исследуемых гидролизатов:

М – маркер; 1 – мука пшеничная (контроль); 2 – экструдат муки (контроль);

3 – мука пшеничная + КФПА; 4 – экструдат муки + КФПА

5 – мука пшеничная + ФС; 6 – экструдат муки + ФС

На ДДС-электрофореграмме показана возможность применения ферментов для гидролиза муки и экструдата (см. рис.). Результаты подтверждают, что использование ФП КФПА и ФС, содержащей протеазу, эндопептидазу и альфа-амилазу, эффективно для гидролиза аллергенных высокомолекулярных белков.

Аминокислотный состав белков пшеницы (глиадина и глютена) придает определенные свойства ферментолизату на основе данного вида сырья. По литературным данным известно, что ферментный гидролиз «разрывает» связи между аминокислотами так, что в конце ами- нокислотной цепочки остается глутаминовая кислота.

Кроме глутаминовой кислоты белок клейковины пшеницы содержит в большем количестве пролин, серин и глицин. Результаты электрофореза демонстративно свидетельствуют о снижении в процессе гидролиза молекулярной массы белков, что говорит о наличии в составе фер-ментолизатов аминокислот и низкомолекулярных пептидов.

Поэтому полученные ферментолизаты пшеницы исследовали на состав свободных аминокислот (табл. 2).

Таблица 2

Аминокислота, г/100 г образца	Образец 1 (пшеница без ФП)	Образец 2 (гидролизат с КФПА)	Образец 3 (гидролизат с ФС)
Аспарагин	0,168	0,190	0,187
Треонин	0,272	0,660	0,559
Серин	0,057	0,350	0,288
Глутаминовая кислота	0,141	0,370	0,390
Пролин	0,044	0,380	0,395
Глицин	0,022	0,080	0,077
Аланин	0,027	0,160	0,240
Цистеин	–	–	–
Валин	0,340	0,420	0,410
Метионин	0,190	0,270	0,284
Изолейцин	0,094	0,240	0,233
Лейцин	0,380	0,620	0,590
Тирозин	–	0,100	0,099
Фенилаланин	–	0,300	0,287
Гистидин	0,304	0,890	0,778
Лизин	0,063	0,150	0,142
Триптофан	0,290	0,580	0,520
Аргинин	–	–	0,010
Всего	2,392	5,760	5,489

Состав свободных аминокислот гидролизатов пшеницы

Анализ аминокислотного состава показал увеличение в процессе гидролиза свободных аминокислот – глутаминовой кислоты, серина, пролина и глицина от 2,5 до 9,0 раза соответственно по сравнению с контрольным вариантом.

Заключение. В результате проведенных исследований была показана возможность применения ферментного препарата КФПА и ферментной системы с тем же комплексом ферментов на степень гидролиза высокомолекулярных белков клейковины. Результаты экспериментов демонстрируют использование ФП КФПА и ферментной системы, что подтверждено материалами исследований. Также увеличение в процессе гидролиза показателей свободных аминокислот играет ключевую роль при составлении рецептур сбалансированных безглютено-вых продуктов за счет повышенной усвояемости низкомолекулярных белков.