Разработка биотехнологии фитопробиотика и оценка его качества

Проблема дисбиотических нарушений микробиоценозов организма человека в настоящее время является весьма актуальной и требует практических решений. Результаты многочисленных экспериментальных исследований свидетельствуют об эффективности применения пробиотиков с лечебной и профилактической целью [1, 2].

Следует отметить, что одним из наиболее распространенных и значимых нарушений кишечного микробиоценоза является недостаточность бифидобактерий, которые присутствуют в кишечнике на протяжении всей жизни здорового человека и служат индикатором микроэко-логического статуса организма. Выявлена корреляция между содержанием бифидобактерий в микробиноме и резистентностью макроорганизма к инфекции [3, 8]. Значительное снижение 12

их количества в желудочно-кишечном тракте ведет к глубоким нарушениям процессов пищеварения и всех видов обмена. На фоне дефицита бифидофлоры наиболее активно проявляются патогенные свойства стафилококка, прошив, грибов и др. [4].

Для повышения эффективности биопрепаратов для коррекции микробиома весьма перспективным является создание пробиотиков нового поколения, содержащих бифидобактерии и новые пребиотические субстанции растительного происхождения.

Целью данной работы является разработка многокомпонентного фитопробиотика на основе сочетания консорциума бифидобактерий и растительного сырья - кипрея узколистного.

Материалы и методы

Объектами исследования служили водный экстракт кипрея узколистного, штаммы Bifidobacterium longum B379М , Bifidobacterium bifidum 8 3 и Bifidobacterium adolescentis DSM 283 , полученные из Всероссийской коллекции микроорганизмов ФГУП ГосНИИ «Генетика», активизированные биотехнологическим методом, разработанным ВСГУТУ.

Для получения фитопробиотика использовали консорциум бифидобактерий Bifidobacterium adolescentis DSM 278 , Bifidobacterium bifidum 8 3 и Bifidobacterium longum B379М .

Для приготовления экстракта кипрея узколистного применяли общепринятую рецептуру: на 200 мл воды использовали 10 г сухого растительного сырья, нагревали при температуре 120 °С в течение 15 мин. Осадок отделяли путем фильтрования через бумажный фильтр. Бактерии выращивали на питательной среде на основе молочной сыворотки с внесением ростовых компонентов и экстракта кипрея узколистного.

Бифидобактерии культивировали при 37 °С в колбах объемом 500 мл. В качестве инокулята использовали культуры бифидобактерий стационарной фазы роста, выращенные на сывороточной среде.

О росте биомассы судили по изменению оптической плотности, длина волны - 580 нм. Количество жизнеспособных клеток бифидобактерий определяли методом предельных разведений на среде ГМК.

Адгезивные свойства изучали на формалинизированных эритроцитах по развернутому методу В.И. Брилис [5].

Все опыты проводили в 3-5-кратной повторности. Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью пакета программы Statistica 6. Использовали непараметрический критерий Манна - Уитни (для сравнения независимых выборок). Значимыми считали различия, если вероятность ошибки р≤0,05.

Результаты исследований

Ранее было изучено влияние экстракта кипрея узколистного на биохимическую активность бифидобактерий Bifidobacterium adolescentis DSM 278 , Bifidobacterium bifidum 8 3 и Bifidobacterium longum B379М , которые считаются наиболее физиологичными и выделены из кишечника здоровых людей.

Установлено, что экстракт кипрея обладает бифидогенными свойствами и стимулирует рост бифидобактерий. На основании проведенных исследований была оптимизирована питательная среда для культивирования бифидобактерий с использованием экстракта кипрея узколистного [7]. В качестве инокулята использовали консорциум бифидобактерий, включающий Bifidobacterium adolescentis DSM 278 , Bifidobacterium bifidum 8 3 и Bifidobacterium longum B379М в соотношении 30:30:40, что, по данным российских исследователей, соответствует таковому в составе микрофлоры толстой кишки здоровых людей.

Характеристика инокулята представлена в таблице 1.

Таблица 1

Характеристика инокулята

Показатели	Бифидобактерии B. longum B379М, B. bifidum 8 3 , B. adolescentis DSM 278 в соотношении 30:30:40
Внешний вид и консистенция	консистенция однородная, цвет от белого до кремового
Вкус и запах	вкус мягкий кисломолочный
Активность, ч	10 ± 2
Кислотность, ° Т	65 ± 4
Активная, рН	4,8 ± 0,06
Адгезивность	высокоадгезивный
Показатели выживаемости в ЖКТ: Рост при: 2 % NaСl, 4 % NaСl, 0,4 % фенола, 20 % желчи, 40 % желчи, рН=4,5 рН=7,5	+ -+ + -+ +

Из данных, представленных в таблице 1, видно, что консорциум бифидобактерий характеризуется достаточно высокой биохимической активностью, о чем свидетельствует продолжительность ферментации молока, обладает устойчивостью к соли, желчи и выживает в достаточно широком диапазоне рН. Высокие адгезивные свойства консорциума свидетельствуют о способности бифидобактерий прикрепляться к эпителиальным клеткам человека, предотвращать фиксацию на них патогенных микроорганизмов и играть важную роль в повышении колонизационной резистентности.

На основании результатов исследований установлено, что разработанный инокулят на основе консорциума разного видового состава бифидобактерий обладает ценными биотехнологическими свойствами.

В дальнейших исследованиях изучали технологические параметры культивирования консорциума бифидобактерий на питательной среде, содержащей водный экстракт кипрея узколистного. Результаты исследований представлены на рисунках 1, 2.

Продолжительность культивирования, ч

Контроль

30%

Рисунок 1 – Влияние водного экстракта кипрея узколистного на наращивание биомассы при совместном культивировании Bifidobacterium adolescentis DSM 283, Bifidobacterium bifidum 8 3 и Bifidobacterium longum В379М

Из данных, представленных на рисунке 1, видно, что в опытном образце прирост биомассы идет интенсивнее в сравнении с контрольным, о чем свидетельствует более высокая оптическая плотность. Через 16 ч культивирования количество жизнеспособных клеток бифидобактерий в опытном образце составляет 1011 КОЕ в см3, тогда как в контрольном образце подобное значение отмечено через 22 ч (рис. 2).

■ Контроль

■ 30%

Рисунок 2 – Влияние водного экстракта кипрея узколистного на рост консорциума бифидобактерий

На основании полученных результатов научно обоснованы технологические параметры производства фитопробиотика. С учетом бактерицидных свойств кипрея выбрана оптимальная доза экстракта кипрея 30 % в питательной среде. При этом продолжительность культивирования составляет 16 ч, а количество жизнеспособных клеток бифидобактерий - 10¹¹ КОЕ в см³.

Качественная характеристика фитопробиотика представлена в таблице 2.

Таблица 2

Показатели качества и безопасности фитопробиотика

Наименование показателя	Контроль	Опыт
1	2	3
Консистенция и внешний вид	однородная	однородная
Цвет	от белого до кремового	светло-коричневый, с белыми вкраплениями
Вкус и запах	чистый, слегка кисловатый, без посторонних привкусов	чистый, со специфическим вкусом кипрея узколистного
Предельные значения рН	5,5-7,5	5,5-7,5
Температура при выпуске с предприятия, °С, не более	4±2	4±2
Количество бифидобактерий на конец срока годности, КОЕ в 1 см3, не менее	2•1010	8•1011
Пищевые волокна, мг/100 г, не менее в том числе:	-	0,5
растворимые	-	0,47
нерастворимые	-	0,13

Продолжение таблицы 2

1	2	3
Индекс адгезивности	5,4	6,1
Объем продукта (см3), в котором не допускаются: БГКП (колиформы)	10	10
S. aureus	10	10
Патогенные микроорганизмы (в том числе сальмонеллы)	100	100
Дрожжи, плесени, КОЕ в 1 см3, не более	5	5

Разработанный фитопробиотик характеризуется высокими адгезивными свойствами, содержит пищевые волокна и может быть рекомендован для коррекции микробиоты желудочнокишечного тракта.

Выводы

На основании проведенных исследований разработана биотехнология фитопробиотика, содержащего в качестве пробиотика консорциум бифидобактерий разного видового состава, а в качестве пребиотика – растительное сырье, кипрей узколистный, который является источником биологически активных веществ. Установлено, что фитопробиотик содержит высокое количество жизнеспособных клеток и обладает синбиотическими свойствами.