Реакция перевиваемой линии клеток MDBK на изменение концентрации СО2

Для нынешнего этапа развития клеточной биотехнологии и изучения биологии клеток в культуре характерно, с одной стороны стремление получить конкретные результаты в производстве биопродукции, а с другой – более углубленного изучения клетки в условиях искусственного выращивания.

Дело в том, что культура клеток in vitro – это динамичная система взаимодействующих составляющих элементов (клеток), которые находятся в постоянном размножении, развитии, отмирании. Создание оптимальных условий жизнедеятельности клеток вне организма – одна из основных проблем клеточной биотехнологии.

Развитие важнейших и наиболее перспективных современных направлений фундаментальных и прикладных исследований в области биологии, медицины и ветеринарной медицины, а так же создания новых биомедицинских технологий невозможно без широкого использования культур клеток человека, животных.

СО 2 является компонентом воздуха и вовлечен в многочисленные биохимические реакции, происходящие в клетке. Изменение концентрации СО 2 может оказывать существенное воздействие на процессы роста клеточных линий. В процессе культивирования клеток животных in vitro в лабораторных условиях часто используют 5 % содержание углекислого газа в атмосфере инкубатора. Некоторые исследователи отмечают благоприятное воздействие относительно высоких концентраций СО₂ (от 5 до 10%) на развитие 8- клеточного зародыша хомячка in vitro (Ocon М. et al., 2003). В то же время показано, что 100% СО 2 уменьшает рост и стимулирует апоптоз клеток рака яичников человека линий НО8910 и SKOV3, как и других опухолевых клеток (Agostini A. et al., 2002; Schmidt A. et al., 2005). Стимулирующее влияние СО 2 в концентрации 5-7% на пролиферативную активность перевиваемой культуры клеток LEK, полученных из легкого эмбриона крупного рогатого скота, было показано ранее (Хамзина Е.Ю., 2010)

Цель. Определить влияние 5 и 7% концентрации СО 2 на пролиферативную и митотическую активность перевиваемой линии клеток MDBK.

Материалы и методы. Перевиваемую линию клеток MDBK культивировали монослойно в стандартных условиях (Дьяконов Л.П., 2009) и в присутствии 5 - 7% концентрации СО2. Контролем служила культура, выращенная в термостате без доступа СО2. Исходная концентрация засеваемой клеточной суспензии составляла 100 тыс. клеток на мл среды. Для последующего подсчета митотического индекса монослой выращивали на предметных стеклах. Через 72 ч культивирования проводили подсчет индекса пролиферации (ИП), для чего клеточный монослой снимали раствором трипсина с версеном, получая клеточную суспензию. Клетки считали в камере Горяева. Индекс пролиферации определяли по формуле ИП=X\Y*2200, где Y- количество засеянных клеток, а Х- общее количество выросших клеток, 2200-степень разведения. Размер клеток определяли путем их осаждения центрифугированием в течение 10 мин при 1500 об/мин из трипсинизированной суспензии. После чего удаляли надосадочную жидкость, осадок наносили на предметное стекло, окрашивали люминесцентным красителем акридиновым оранжевым, накрывали покровным стеклом и определяли размер при помощи объектива с микрометром на микроскопе МЛД -1У11. Подсчет количества митозов проводили в 10 полях зрения на пластинке с монослоем, окрашивая его акридиновым оранжевым. Статистическую обработку проводили по критерию Вилькоксона.

Результаты. Через 72 ч роста количество клеток по сравнению с исходным, закономерно увеличилось. Однако, рост клеток в опыте и контроле было неодинаковым. Согласно данным рис. 1 через 3 суток роста ИП в контрольной культуре был минимальным по сравнению с культивированием в условиях 5 % СО 2 , 7% СО 2 .

Количество митозов при культивировании MDBK в контрольных условиях и 5 % СО2 значительно не различалось (рис.2). При культивировании в условиях 7 % СО2 количество митозов было достоверно больше.

Размер клеток MDBK в контроле и опыте достоверно не отличались (рис.3).

Выводы. Таким образом, 5% и 7% концентрации углекислого газа оказывают стимулирующее действие на рост перевиваемой линии клеток MDBK. Наибольшее количество митозов выявлено при культивировании MDBK в атмосфере с 7% СО 2 . Вероятно, это связано с тем, что в условиях легкой гипоксии увеличивается длительность фазы логарифмического роста по сравнению с контролем и в присутствии 5 % СО 2 , в то же время достоверного различия размера клеток между контролем и опытом нет.

ЛИТЕРАТУРА: 1. Agostini, A. Impact of different gases and pneumoperitoneum pressures on tumor growth during laparoscopy in rat model/

A. Agostin, F. Robin, P. Jais et al.// Surg. Endosc. — 2002. — Vol. 16. - P. 529532. 2. Ocon, O.M. Disruption of Bovine Oocytes and Preimplantation Embryos by Urea and Acidic pH/ O.M. Ocon, P.J. Hansen// J DAIRY SCI April 1. – 2003. – Vol.86. – №4. - P.1194-1200. 3. Schmidt, A.I. Exposure to carbon dioxide and helium reduces in vitro proliferation of pediatric tumor cells/ A.I. Schmidt, M. Reismann, J.F. Kübler, G .Vieten, C. Bangen, A. Shimotakahara, S. Glüer, R. Nustede, B.M. Ure/ / http:// www.ncbi. nlm. nih. gov/pubmed?term=*SchmidtAI[Autor]. 4. Дьяконов, Л.П. Животная клетка в культуре/ Л.П. Дьяконов - М.: Изд-во «Спутник+».- 2009. – С.21-40. 5. Плотникова, Э.М. Зависимость митотического деления и скорости роста перевиваемой линии клеток MDBK от концентрации CO₂/ Э.М. Плотникова, Е.Ю. Хамзина, Ю.М. Кириллова, И.С. Глаголева// Актуальные проблемы патофизиологии. – Материалы XVII Межгородской конференции молодых ученых. – С.-П.: Изд-во «СПбГМУ». - 2011.-С.128-129. 6. Хамзина, Е.Ю. Сочетанное влияние адреналина и СО 2 в разных концентрациях на митотическую активность перевиваемой линии клеток LEK/ Е.Ю. Хамзина, Ю.М. Кириллова// Тезисы. - VII Международная конференция «Молекулярная медицина и биобезопасность». - М. - 2010. -С.196 - 197.

РЕАКЦИЯ ПЕРЕВИВАЕМОЙ ЛИНИИ КЛЕТОК MDBK НА ИЗМЕНЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ СО 2

Глаголева И.С.

Резюме

Изменение концентрации СО 2 оказывает воздействие на процессы роста клеточных линий. 5% и 7% концентрации углекислого газа оказывают стимулирующее действие на рост перевиваемой линии клеток MDBK. Наибольшее количество митозов выявлено при культивировании клеток в атмосфере с 7% СО 2 .

THE REACTION OF MDBK CELL LINE ON CHANGE OF CO 2 CONCENTRATION

Glagoleva I.S. Summary

Change of СO 2 concentration affects on cellular growth process. 5 % and 7 % СО 2 concentration has a favorable effect on growth of MDBK cell line. The mitosis largest number was revealed in cells cultured in an atmosphere containing 7 % СО₂.