Результаты лечения больных с диагностированными регионарными метастазами дифференцированного рака щитовидной железы

С 2005 по 2015гг. в Российской Федерации количество больных с впервые установленным диагнозом ракащитовидной железы (РЩЖ) выросло в 1,5 раза с 1168 до 1750 в год [2]. За 30 лет в мире отмечается неуклонный рост заболеваемости, при этом, благодаря улучшению лабораторной диагностики и совершенствованию методов верификации онкологического процесса, повышается выявляемостьданной патологии [8]. Стоит подчеркнуть, что высокодифференцированный РЩЖ (фолликулярный и папиллярный морфологические формы) (ВДРЩЖ) составляет до 90-95% от всех типов злокачественных опухолей щитовидной железы [3]. Радиойодтерапия (РЙТ) играет ключевую роль в случаях распространенного РЩЖ и при потенциально высоком риске рецидива [6]. Благоприятными факторами при РЙТ является молодой возраст и небольшие размеры метастазов [5]. У ряда больных с РЩЖ развивается йодрезистентность, которая существенно ухудшает прогноз –5летняя болезнь-специфическая выживаемость пациентов с радиойодрезистентностью составляет 66% [3, 7], а 10-летняя выживаемость не превышает 10% [5, 9]. В связи с противоречивым отношением к выполнению профилактических лимфодиссекций и намечающейся тенденцией к увеличению числа органосохраняющих операций нами проведена работа для поиска путей дооперационной диагностики радиойодрезистентности.

Материалы и методы

В группу исследования было включено67больных РЩЖ, у которых по результатам контрольнойпосттерапевтическойсцинтиграфии, УЗИ шеи, а также по показателям биохимических маркеров (тиреоглобулин (ТГ), анититела к тиреоглобулину(АТ к ТГ)) были выявлены признаки регионарного метастазирования. Им было проведено повторное хирургическое лечение.

Женщин оказалось больше (n=42, 63%), чем мужчин (n=25,37%). Средний возраст составил 51,9 ± 14,06 лет и варьировал от 22 до 72 лет. Объем первичного оперативного вмешательства, согласно представленной медицинской документации у пациентов данной группы приведен в таблице 1.

Таблица 1. Распределение 67 пациентов с дифференцированным раком щитовидной железы по объему хирургического вмешательства

Объем оперативного вмешательства	Частота	Процент	Валидный процент	Накопленный процент
Тиреоидэктомия	5	7,5	7,5	7,5
Тиреоидэктомия   с лимфаденэктомией	30	44,8	44,8	52,3
Повторные операции	32	47,7	47,7	100,0
Итого	67	100,0	100,0	-

Как видно из представленных данных, пациентам с дифференцированным раком щитовидной железы (ДРЩЖ) до момента обращения в РНЦРР и «НМИЦ радиологии» в 47,7% случаев были выполненымногократные хирургические вмешательства, включающее в себя удаление ткани щитовидной железы в сочетании с различными видами лимфодиссекции. У 4 пациентов проведено двухэтапное хирургическое лечение - на первом этапе выполненагемитиреоидэктомия, по данным гистологического исследования подтвержден РЩЖ. На втором этапе им выполнена завершающая тиреоидэктомия с центральной лимфодиссекцией (ТЭ с ЦЛД).

После хирургического лечения всем пациентам было проведено плановое гистологическое исследование: у 61 пациента (91,0%) выявлен папиллярный рак ЩЖ и у 6 пациентов (9,0%) обнаружен фолликулярный вариант РЩЖ.У всех 67 пациентов, в том числе по данным совмещенной однофотонной эмиссионной компьютерной томографии и рентгеновской компьютерной томографии (ОФЭКТ-КТ), было отмечено поражение лимфатических узлов шеи, что является признаком регионарного метастазирования и требуетдальнейшего лечения.

Интервал от первого хирургического лечения до второго варьировал в пределах от 1 месяца до 5 лет. В среднем повторное хирургическое лечение проводилось через 9,36 ± 15,11месяцев. У 47 пациентов (70,1%) повторное оперативное лечение осуществлялось в срок до 12 месяцев. У 20 больных (29,9%) повторное хирургическое лечение было выполнено более чем через год после первой операции. Двум пациентам через 5 лет после оперативного лечения было проведено повторное хирургическое вмешательство.

РЙТ была выполнена 61 пациенту (90,0%), 6 пациентам (9,0%) осуществлялась диагностическая сцинтиграфия всего тела (СВТ). У 32 (47,8%) пациентов по данным посттерапевтическойсцинтиграфии и СВТ было выявлено накопление радиофармпрепарата (РФП) вне ложа щитовидной железы, что по данным ОФЭКТ-КТ соответствовало накоплению в различных лимфатических узлах. У 35 (52,2%) больных обнаружено увеличение лимфоузлов (ЛУ) по данным ОФЭКТ-КТ без накопления I.

Всем пациентам после выявления регионарных метастазов проведено хирургическое лечение. Объем хирургического вмешательства определялся характером метастазирования и проведенным ранее хирургическим лечением. Трем больным двусторонние операции

(футлярно-фасциальная шейнаялимфаденэктомия (ФФШЛАЭ)) проведены в два этапа, четырем – выполнены одномоментно. Количествоудаленныхпри повторном хирургическом лечении лимфоузлов составило от 4-х до 63-х (в среднем 30,59). По данным постоперационного планового гистологического исследования метастатическое поражение выявлено в 1-м – 34-х лимфоузлах (в среднем 11,67).В исследовании проводилась оценка наибольшего диаметра удаленных метастатических лимфоузлов. Средний диаметр составил 16,65мм (от 3мм до 45мм).При детальном анализе патоморфологического послеоперационного материала у 26 пациентов (38,8%) выявленопрорастание капсулы лимфоузла или тотальное замещение лимфоузла опухолевыми массами, а у 41пациента (61,2%) капсула лимфоузла не была поражена.

После получения морфологического материала проводилось определение уровня экспрессии генов и статуса гена гена BRAF (дикий тип / мутация V600E) в метастатических лимфоузлах. Процедура от момента получения образца ткани до получения результатов полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией состояла из трех этапов: выделение мРНК из образца ткани, проведение обратной транскрипции, РВ-ПЦР (ПЦР в «реальном времени» или количественная ПЦР).Определение мутации V600E в гене BRAF проводилась методом цифровой капельной ПЦР (ddPCR). Учет результатов выполнялся в программе «QuantaSelf 16». Средние значения данных переносились из таблицы программы «QuantaSelf 16» в таблицу Excel для дальнейшей статистической обработки.

Результаты и обсуждение

В работе исследовалась экспрессия 8 генов:ингибитораапоптоза TERT , тиреоглобулина TG , натрий-йодногосимпортераNIS SLC5 , кератина 19 KRТ19 , кератина 5 KRТ5 , онкогена ERBB2 , а также 2-х референсных генов GUSB и B2M .

Распределение средних значений экспрессии генов и частоты встречаемости мутации гена BRAF V600E в метастатических лимфоузлах представлено в таблице 2.

Таблица 2. Средние значения экспрессии генов и частоты встречаемости мутации гена BRAF V600E в метастатических лимфоузлах

Гены	Среднее	Средне          кв. отклонение	N
TG	7,6500	2,66716	67
SLC5 (NIS)	4,1936	5,69500	67
KRT19	7,3784	3,22851	67
KRT5	7,6623	9,72643	67
ERBB2	3,3917	1,10207	67
TERT	7,3765	11,55798	67
BRAF V600E	25,5529	62,34900	67
BRAF дикого типа	404,0647	495,93174	67
BRAF V600E / BRAF дикого типа	0,0809	0,14216	67

Как видно из данных, приведенных в таблице2, при анализе средних величин распределение среднеквадратичного отклонения оказалось неравнозначным. При наличии вметастатических лимфоузлах аллелей гена BRAF дикого типа и гена BRAF с мутацией V600E среднеквадратичное отклонение было более выражено (495,93 и 62,34).

Оценка статистической значимости (метод Монте-Карло) экспрессии генов, мутантного статуса гена BRAF V600E и клинических данных (количество метастатических лимфоузлов, размер, прорастание капсулы) представлена в таблице 3.

Таблица 3. Статистические результаты(метод Монте-Карло) исследований экспрессии генов, мутантного статуса гена BRAF (V600E) и клинических данных

			у?	Os м	м	Гм cq cq		8 ^ cq	С S н о о cq	о g	о Н >• л t: щ н	<и 2 cd Он	S я П и
Р (Значимость)		0,044	0,038	0,183	0,146	0,161	0,180	0,000	0,014	0,000	0,233	0,102	0,181
99% ДИ	Нижняя граница	0,039	0,033	0,173	0,137	0,152	0,170	0,000	0,011	0,000	0,222	0,094	0,171
	Верхняя граница	0,050	0,043	0,193	0,155	0,171	0,190	0,001	0,017	0,000	0,244	0,109	0,191

Следует отметить, что уровень экспрессии генов TG , SLC5 (NIS), количество мутантных аллелейгена BRAF (V600E),количество аллелей гена BRAF дикого типа и отношение количества мутантных аллелейBRAF V600E к количеству аллелей гена BRAF дикого типа оказались статистически значимыми (р=0,044; р=0,038; р=0,000; р=0,014 и р=0,000, соответственно). При оценке уровня экспрессии генов TERT, KRТ19, KRТ5,ERBB2 , а также данных анализа метастатических лимфоузлов (количество, размер, прорастание капсулы) статистическая значимость не выявлена.

По результатам посттерапевтического ОФЭКТ/КТ и диагностической СВТ пациенты были распределены на две подгруппы – с накоплением РФП в лимфоузлах (йодпозитивные) и без накопления РФП в лимфоузлах (йоднегативные) (рисунок 1).

Рис. 1. Распределение пациентов по данным ОФЭКТ/КТ и диагностической СВТ.

У 32пациентов (47,8%) по данным посттерапевтическойсцинтиграфии и диагностической СВТ выявлено накопление РФП в лимфатических узлах. По данным ОФЭКТ-КТ у 35 (52,2%) больных выявлены метастатические ЛУ без накопления

РФП.Вышеуказанное позволило нам выделить подгруппы с йоднегативными и йодпозитивными регионарными метастазами. В дальнейшем производился сравнительный анализ между выделенными подгруппами. Распределение средних величин в подгруппах представлено в таблице 4.

Таблица 4. Сравнительная оценка средних величин экспрессии генов и частоты встречаемости мутации гена BRAF V600E в йоднегативной и йодпозитивнойподгруппах

Гены	Йоднегативные пациенты	Йодпозитивные пациенты	t-value	p
TG	7,1801	8,4109	-1,57928	0,120840
SLC5 (NIS)	3,4566	6,6875	-1,95433	0,056501

KRT19	7,5610	8,4797	-0,98742	0,328389
KRT5	7,6912	11,0078	-0,98526	0,558728
ERBB2	3,2110	3,4469	-0,58884	0,558728
TERT	7,7544	6,5453	0,33726	0,737390
BRAF V600E/ BRAF дикого типа	0,1002	0,0182	2,17674	0,034558
BRAF дикого типа	300,8206	843,7667	-2,57955	0,013081
BRAF V600E	27,5588	3,6467	1,62490	0,110872

Исходя из представленных данных, в подгруппах с йоднегативными и йодпозитивными регионарными метастазами выявлены различия по частоте встречаемости гена BRAF дикого типа и соотношению BRAF V600E/ BRAF дикого типа(р=0,013 и р=0,034). При оценкеэкспресии SLC5 (NIS) в исследуемых подгруппах выявлена статистическая значимость (р=0,05).

Частота встречаемости мутаций гена BRAF V600Eв подгруппе с йоднегативными метастазами оказалась выше почти в 8 раз по сравнению с подгруппой йодпозитивных пораженных лимфоузлов (р=0,11). При этом частота встречаемости аллелей BRAF дикого типа составила 300,8 в подгруппе с йоднегативными метастазами, а в подгруппе с йодпозитивными метастазами – 843,7 (р=0,013). При статистическом анализе средних величин экспрессии генов ( TG, TERT, KRТ19, KRТ5,ERBB2 ) между подгруппами сйоднегативными и йодпозитивными метастатическими лимфоузламизначимых различий не выявлено.

При детальном анализе двух независимых выборок (йоднегативных и йодпозитивных метастатических лимфоузлов) нами использовался F-критерий Фишера (таблица 5).

Таблица 5. Тест проверки двух независимых выборок (F-критерий Фишера)

	F	р	р (двухсторонняя)	95% ДИ
				Нижняя	Верхняя
TG	0,327	0,570	0,108	-2,75480	0,28274
			0,101	-2,72627	0,25421
SLC5 (NIS)	5,380	0,025	0,058	-6,33713	0,11508
			0,171	-7,70660	1,48454
KRT19	0,037	0,848	0,369	-2,63824	0,99854
			0,393	-2,75531	1,11560
KRT5	1,276	0,264	0,422	-9,29210	3,95387
			0,462	-10,01392	4,67569
ERBB2	0,559	0,458	0,510	-1,03925	0,52307
			0,540	-1,11018	0,59400
TERT	0,374	0,543	0,650	-5,41329	8,60152
			0,623	-4,91750	8,10574
BRAF V600E	2,573	0,115	0,141	-7,39440	50,27455
			0,045	0,47131	42,40884
BRAF дикого типа	9,744	0,003	0,009	-963,16852	-143,50280
			0,073	-1165,4554	58,78409
BRAF V600E / BRAF дикого типа	4,395	0,041	0,032	0,00714	0,15382
			0,005	0,02554	0,13542
К-во метастатических л/у	0,883	0,352	0,384	-9,762	3,821
			0,450	-10,960	5,019
Размер л/у	9,434	0,003	0,046	-11,027	-0,091
			0,104	-12,351	1,234
Прорастание капсулы	1,395	0,243	0,236	-0,472	0,119

0,248

-0,483

0,130

По результатам проведенного сравнения (F-критерий Фишера) выборочных дисперсий двух выделенных подгрупп полученные значения среднихвеличин различались по экспрессии гена SLC5 (NIS) (р=0,025), частоте встречаемости гена BRAF дикого типа (р=0,003), отношению частоты мутантных (V600E) / немутантных аллелей гена BRAF (р=0,041), максимальному размеру лимфоузла (р=0,003). Показатели средних величин экспрессии генов TG, KRT19, KRT5, ERBB2, TERT , числа мутаций BRAF V600E, пораженных лимфоузлов и прорастания капсулы значимо не различались.

На основании проведенного исследования экспрессии генов SLC5 (NIS), KRT5, ERBB2 , наличия/ отсутствиямутаций гена BRAF V600E, отношению частоты мутантных (V600E) / немутантных аллелей гена BRAF в метастатических лимфоузлах предложена прогностическая модель (таблица 6).

Таблица 6. Прогностическая модель выделенных подгрупп (логистическая регрессия)

N=67	Параметры: числовариантов в модели: 5; кодировка для 2-х групп сравнения: 0 – некопятЙОД, 1 – копят ЙОД WilksLambda: 66100 approx. F (5,43)=4,4106p<0,0025
	Wilks Lambda	Partial Lambda	F- remove (1,43)	p-value	Toler.	1-Toler. (R-Sqr.)
SLC5 (NIS)	0,661397	0,999401	0,025768	0,873219	0,732956	0,267044
KRT5	0,682341	0,968726	1,388218	0,245186	0,708233	0,291767
ERBB2	0,745834	0,886258	5,518625	0,023479	0,555589	0,444412
BRAF дикого типа	0,794582	0,831886	8,689774	0,005154	0,792465	0,207535
BRAF V600E / BRAF дикого типа	0,809710	0,816343	9,673914	0,003313	0,611502	0,388498

Группа	Классификационнаяматрица Ряды: наблюдаемые классификации Столбцы: предсказанные классификации
	Percent Correct	G_1:0 p=0,50000	G_2:1 p=0,50000
G_1:0	90,90909	31	7
G_2:1	75,00000	4	25
Всего	85,71429	35	32

Как следует из таблицы 6, определениеэкспрессии генов SLC5, KRT5, ERBB2 ,статуса гена BRAF (дикий тип), отношениячисла мутантных (V600E) / немутантных аллелей гена BRAF в метастатических лимфоузлах позволяет предсказать вероятность накопления или ненакопления лимфоузлами РФП в 85,7% случаев. При этом йодрезистентость разработанная модель может предсказать в 90,9% случаев, а накопление I в лимфоузлах – в 75,0% случаев. Стоит отметить, что в данной прогностической модели основной вклад вносит определение статуса гена BRAF (немутантный статус гена BRAF и отношение количества мутантных аллелей V600E к количеству немутантных аллелей гена BRAF (р=0,005 и р=0,003)).

Заключение

Предложена модель прогнозирования вероятности накопления или ненакопления лимфоузлами РФП у больных, оперированных по поводу РЩЖ.В исследованной группе больных с РЩЖ интервал после первого хирургического лечения до прогрессирования в среднем составил от 1 до 5-и лет. После повторного хирургического вмешательства по данным патогистологического исследования средний диаметр удаленного метастатического лимфатического узла составил 16,65мм (от 3мм до 45мм). Прорастание капсулы лимфоузла или тотальное замещение лимфоузла опухолевыми массами отмечено у 26 пациентов

(38,8%), а у 41 пациента (61,2%) капсула лимфоузла не была поражена. По данным посттерапевтического ОФЭКТ/КТ и диагностической СВТ выделены пациенты с накоплением изотопа в лимфоузлах –йодпозитивные и без накопления –йоднегативные.

При проведении исследованияэкспрессии панели генов (8 генов) в удаленных метастатических лимфоузлах пациентов, относящихся к йод-негативной и йод-позитивной группам,выявлены различия средних значений экспрессии гена SLC5 (NIS), частоты встречаемости гена BRAF дикого типа и соотношения частот мутантного (V600E) и немутантного аллелей гена BRAF (р=0,05; р=0,013 и р=0,034). При анализе сравниваемых параметров по F-критерию Фишера две группы пациентов различались по экспрессии гена SLC5 (NIS)(р=0,025), количеству немутантных аллелей гена BRAF (р=0,003), соотношению количества мутантных / немутантных аллелей гена BRAF (р=0,041) и по максимальному размеру лимфоузла (р=0,003).

Предложенная модель прогнозирования позволяет предсказать вероятность накопления или ненакопления лимфоузлами РФП в 85,7% случаев, при этом йодрезистентость–в 90,9% случаев, а накопление ³ I в лимфоузлах – в 75,0% случаев.Немутантный статус гена BRAFи отношение числа мутантных / немутантных аллелей гена BRAF являются наиболее значимыми показателями (р=0,005 и р=0,003).

Выводы

• 1.    Показатели уровня экспрессии генов SLC5 , KRT5, ERBB2, немутантный статус гена BRAF, отношение числа мутантных (V600E) / немутантных аллелей гена BRAF в биопсийном(пункционном)материале позволяет предположить наличие йодрезистентности в метастатическом лимфоузле и cформировать показания к максимально возможному объему лимфодиссекции.

• 2.    Возможность такого прогноза по результатам исследования первичной опухоли требует дальнейшего уточнения.