Сравнительная характеристика и оценка жизнеспособности эмбрионов, получаемых от здоровых и проблемных коров-доноров с разным уровнем молочной продуктивности

Исследования по экспериментальной эмбриологии млекопитающих вызывают не только практический, но и научный интерес (1). Физиология репродуктивных органов и патофизиология эмбрионального развития являются фундаментальными разделами современной биологии. В этом смысле исследования, проводимые по совершенствованию новейших биотехнологических методов управления воспроизводительной функцией, относящихся к трансплантации эмбрионов, представляют уникальную возможность познания закономерностей биологических процессов. Без дальнейшего углубления исследований в области технологических элементов эмбриотрансплантации невозможна реализация на практике результатов таких перспективных направлений, как клонирование, получение тотипотентных эмбриональных стволовых клеток с генными конструкциями для создания множественных линий с генетическим разнообразием, получение трансгенных животных, элиминация нежелательных генов, решение проблем эмбриональной смертности и др.

Анализ результатов собственных исследований авторов в области трансплантации эмбрионов и данных литературы свидетельствует о высокой вариабельности показателей жизнеспособности эмбрионов. В ряде случаев приживляемость эмбрионов может достигать 80 % от числа трансплантированных, но может не превышать 10-17 %. Показано, что эмбрионы, получаемые как от здоровых высокопродуктивных, так и от проблемных коров, к которым относятся особи с функциональными расстройствами воспроизводительной системы вследствие хронических стрессовых воздействий, характеризуются низкой степенью приживляемости, включая случаи, когда они после извлечения были оценены по 5-балльной шкале (по морфологическим признакам) как хорошие и отличные (2, 3). В этой связи исключительное значение имеет выяснение морфологических признаков эмбрионов, получаемых от коров-доноров с разным уровнем молочной продуктивности и физиологическим статусом.

Незначительные отклонения в состоянии здоровья животных оказывают негативное влияние на оплодотворяемость яйцеклеток и качество эмбрионов (4, 5). Даже при 100 % положительной реакции суперовуляции у проблемных коров качество большинства полученных эмбрионов может оказаться неудовлетворительным при полном отсутствии пригодных для трансплантации (6). В целом лишь 29 % извлекаемых у перегуливающих коров эмбрионов являются нормальными, 33 % имеют существенные морфологические отклонения, 38 % — дегенеративные нарушения. При этом как нормальные, так и эмбрионы с морфологическими отклонениями значительно отстают в развитии. При оценке 7-суточных эмбрионов, получаемых от многократно осеменяемых коров и виргинных телок, отмечено, что у первых эмбрионы, как правило, находились на стадии бластоцисты, а у вторых — на стадии морулы. Это дало основание заключить, что у коров, имеющих или имевших нарушения репродуктивной системы, интенсивность развития эмбрионов существенно замедлена, что иногда сопровождается последующей дегенерацией и полной резорбцией последних (7). Для дегенерированных эмбрионов характерно наличие диплоид- ных и полиплоидных клеток. Эмбрионы от проблемных коров имеют на 1/3 больше аномальных кариотипов, чем таковые от здоровых телок (8). В определенной степени эта ситуация является следствием патологических процессов, негативно воздействующих на обменную и гормональную активность развивающихся фолликулов, что подтверждают исследования in vivo и in vitro. Следовательно, репродуктивные нарушения обусловливают низкое качество яйцеклеток, что оказывает влияние на процесс созревания и фертильность последних, а в случае оплодотворения — на эмбриогенез (9). При культивировании ооцитов, полученных от проблемных коров, отмечен высокий выход яйцеклеток с дегенерацией хромосом (блок анафазы) (10). В опытах по культивированию эмбрионов in vitro в аналогичных случаях количество дегенерировавших морул и бластоцист было соответственно в 3 и 2,5 раза больше, чем в контроле, что предполагает увеличение случаев эмбриональной смертности (11).

Генетическое улучшение молочных пород крупного рогатого скота благодаря целенаправленной селекции привело к значительно возросшей молочной продуктивности, что сопровождалось снижением репродуктивной активности маточного поголовья (12). При этом снижение жизнеспособности эмбрионов коррелирует с увеличением удоя, начиная с 5000 кг молока за лактацию. Так, показано, что у коров с высоким генетическим потенциалом продуктивности (при нормальном чередовании волн активности фолликулярного роста и нормальных характеристиках клинических симптомов эструса) в отличие от малопродуктивных животных значительно снижается доля оплодотворяемости яйцеклеток, а в случае оплодотворения увеличивается эмбриональная смертность (12). В этой связи были проведены исследования по детализации и уточнению влияния различных экзогенных и эндогенных факторов (в том числе эндокринных и метаболических нарушений) на качество ооцитов и эмбрионов с учетом молочной продуктивности. Оказалось, что усиленное кормление, необходимое для реализации генетически запрограммированной молочной продуктивности, приводит к эндокринным и метаболическим сдвигам, негативно влияющим на овогенез, оплодотворяемость и эмбриогенез. Так, ооциты от телок с высоким генетическим потенциалом продуктивности при культивировании in vitro после оплодотворения характеризовались низкой интенсивностью дробления и формирования бластоцист. В то же время ооциты от коров с невысоким генетическим потенциалом продуктивности, но оптимальными экстерьерными данными обладали нормальными морфологическими признаками и после оплодотворения развивались до стадии бластоцисты. В результате этих исследований был сделан вывод о том, что в первую очередь к общему снижению плодовитости приводят связанные с метаболическими сдвигами изменения фолликулярной среды и среды яйцепроводов, оказывающие негативное влияние на рост, созревание ооцитов и оплодотворяемость (13).

Снижение плодовитости может быть обусловлено также изменениями среды матки, негативно влияющими на процесс эмбриогенеза. В исследованиях in vitro культур эндометральных тканей матки высокопродуктивных коров показано, что изменение градиента рН происходит посредством поляризации клеток и увеличения секреции простагландина F 2 α , что препятствует развитию эмбриона и в конечном счете может привести к потере его жизнеспособности (14).

Следует обратить внимание на определенную идентичность механизмов снижения жизнеспособности эмбрионов проблемных и здоровых высокопродуктивных коров, причем во всех случаях замедляется скорость развития эмбрионов. В связи с этим представляет интерес анализ в сравнительном аспекте морфологических особенностей и степени надежности существующих методов оценки жизнеспособности эмбрионов, получаемых от здоровых и проблемных коров-доноров с разным уровнем молочной продуктивности, что и было целью нашей работы.

Методика. Объектом исследований служили эмбрионы, полученные от коров-доноров черно-пестрой породы четвертой-пятой лактации с молочной продуктивностью до 5000 и выше 5000 кг молока в год. Условия содержания, кормления и эксплуатации животных соответствовали общепринятым зоотехническим нормам. Подготовку коров для использования в качестве доноров эмбрионов, индуцирование 64

суперовуляции, осеменение, извлечение эмбрионов проводили по методикам и инструкциям Всероссийского НИИ животноводства (ВГНИИЖ) (15). Суперовуляцию вызывали гипофизарными (FSH-P-PgF 2 α ) и сывороточными (ГСЖК-PgF 2 α ) гонадотропинами соответственно по 4- и 2-суточной схемам, которые считаются классическими.

Степень развития и жизнеспособность эмбрионов оценивали на основании морфологических признаков по 5-балльной шкале (методика ВГНИИЖ): 5 — отличные, 4 — хорошие, 3 — удовлетворительные, 2 и 1 — соответственно условно пригодные и непригодные для трансплантации эмбрионы. Для подтверждения определенной по морфологическим признакам степени жизнеспособности эмбрионов проводили дополнительную оценку методом культивирования, принимая во внимание госстандарт на эмбрионы крупного рогатого скота (3, 15-17).

Результаты . Обобщенный анализ морфологической оценки эмбрионов показал, что большая часть из них, полученная от здоровых коров со средней продуктивностью, соответствует возрасту и стадии развития на день извлечения: 68,9, 20,8 и 10,3 % — соответственно нормальные, дегенерированные эмбрионы и неоплодотво-ренные яйцеклетки (табл. 1).

1. Морфологическая оценка эмбрионов и оплодотворяемости яйцеклеток у средне-и высокопродуктивных коров черно-пестрой породы в зависимости от физиологического состояния доноров

Физиологическое состояние и молочная продуктивность коров	Число исследованных эмбрионов	Из них
		нормальные		дегенерированные		неоплодотворенные яйцеклетки
		n	%	n	%	n	%
Ниже 5000 л/год, здоровые Выше 5000 л/год:	456	314	68,9	95	20,8	47	10,3
здоровые	286	160	55,9	73	25,5	53	18,5
проблемные	398	208	52,3	99	24,9	91	22,9
Всего	1140	682	59,8	267	23,4	191	16,8

От высокопродуктивных здоровых и проблемных коров было получено нормальных эмбрионов меньше соответственно на 13,0 и 16,6 %, дегенерированных эмбрионов — больше на 4,7 и 4,1 %, чем от среднепродуктивных; оплодотворяемость яйцеклеток у последних была выше на 12,6-8,2 %.

Эффективность суперовуляции была выше при использовании FSH-P-PgF₂ α по сравнению с реакцией на ГСЖК - PgF₂ α (табл. 2). Однако в обоих случаях наблюдалось значительное влияние физиологического состояния коров-доноров на качество эмбриопродукции. Так, количество высокожизнеспособных эмбрионов было больше у здоровых коров со средней молочной продуктивностью, чем у высокопродуктивных животных. Этот факт подтверждает отрицательное влияние как высокой продуктивности, так и отклонений в физиологическом состоянии коров на жизнеспособность эмбрионов.

2. Оплодотворяемость яйцеклеток и выход эмбрионов хорошего и отличного качества в зависимости от физиологического состояния коров-доноров чернопестрой породы разной продуктивности при использовании для суперовуляции гипофизарных (FSH-P-PgF 2 a ) и сывороточных (ГСЖК-PgF₂ a ) гонадотропинов (%)

Показатель	FSH-P-PgF 2 α			ГСЖК-PgF 2 α
	Здоровые коровы		Проблемные коровы	Здоровые коровы		Проблемные коровы
	ниже 5000 л/год	выше 5000 л/год		ниже 5000 л/год	выше 5000 л/год
Число доноров	46	36	99	76	67	69
Оплодотворяемость Качество эмбрионов, балл:	92,0	79,9	73,9	86,6	69,9	69,9
5	49,1	9,7	8,9	47,7	6,1	6,6
4	9,9	20,1	18,9	7,3	6,1	8,7
3, 2, 1	33,0	50,1	46,1	31,6	57,7	54,6

Более половины интактных эмбрионов, извлеченных у здоровых среднепродуктивных коров-доноров, находилось на стадиях поздней морулы и ранней бластоцисты; на стадиях экспандированной бластоцисты и ранней морулы — 32,1 % эмбрионов (табл. 3). Доля отставших в развитии эмбрионов у высокопродуктивных и проблемных коров составляла соответственно 13,7 и 14,2 % (в целом 4,3 %). При этом четко прослеживалась тенденция отставания в скорости развития как ранних и поздних морул, так и бластоцист. Следовательно, у проблемных и здоровых высокопродуктивных коров снижается скорость развития эмбрионов.

• 3.    Количество эмбрионов на разных стадиях развития у средне- и высокопродуктивных коров черно-пестрой породы в зависимости от физиологического состояния доноров

  Стадия развития эмбриона	Здоровые коровы-доноры				Проблемные коровы-доноры
  	ниже 5000 л/год		выше 5000 л/год
  	n	%	n	%	n	%
  Число клеток:
  2	0,6	1,0	3,9	5,3	4,0	7,6
  4	0,4	1,1	3,9	4,4	2,4	4,5
  8	0,4	1,0	1,9	2,5	1,9	2,0
  16	0,3	1,2	1,1	1,5	0,9	3,9
  Ранняя морула	13,7	16,0	20,6	36,4	40,8	1,8
  Поздняя морула	37,6	40,0	19,9	32,9	28,0	29,9
  Ранняя бластоциста	19,1	22,7	9,1	15,1	5,1	10,1
  Экспандированная бластоциста	12,1	16,1	0,9	1,1	0,8	1,0

  П р и м е ч а н и е. Извлечение эмбрионов проводили на 7-е сут после первого осеменения. Всего исследовано 9487 эмбрионов, в том числе 3733, 2825 и 2929 соответственно от средне-, высокопродуктивных и проблемных коров. Варьирование средних показателей выхода интактных эмбрионов в различных опытах составляло для средне-, высокопродуктивных и проблемных коров соответственно 6,1 ± 0,1¼7,9 ± 0,2; 5,3 ± 0,3¼7,6 ± 0,1; 4,3 ± 0,01¼6,9 ± 0,2 (Р < 0,01).

• 4.    Оценка жизнеспособности эмбрионов средне- и высокопродуктивных коров черно-пестрой породы при культивировании in vitro в зависимости от стадии развития зародыша и физиологического состояния донора

  Группа коров-	Ранняя морула		Поздняя морула		Ранняя бластоциста		Поздняя бластоциста		Всего
  доноров	I	II	I	II	I	II	I	II	I	II
  (удой)		n   %		n   %		n   %		n   %		n    %

  Здоровые (ниже 5000 л/год)	50	47	94	86	83	96,5	47	46	97,8	52	52	100	235	228	97,0
  Здоровые (выше 5000 л/год)	68	34	50	25	17	68,0	47	33	70,2	30	25	83,3	170	109	64,0
  Проблемные	80	40	50	80	55	68,8	64	45	70,3	51	42	82,3	275	182	66,1

При культивировании в течение 24 ч эмбрионов отличного и хорошего качества отмечено, что наименьшей жизнеспособностью обладали эмбрионы на стадии ранней морулы (табл. 4).

П р и м е ч а н и е. I и II — число эмбрионов, соответственно поставленных на культивирование и продолживших развитие.

Следует обратить внимание на важное обстоятельство: если морфологическая оценка жизнеспособности эмбрионов, полученных от среднепродуктивных здоровых коров, практически всегда подтверждалась данными при культивировании in vitro, то этого нельзя сказать относительно эмбрионов, полученных от высокопродуктивных как здоровых, так и проблемных коров. Лишь от 64,0 до 66,1 % эмбрионов от таких коров с оценкой по морфологическим признакам как отличные и хорошие продолжили свое развитие in vitro, то есть оказались жизнеспособными.

Вероятно, потеря жизнеспособности обусловлена не только морфофункциональными дефектами эмбрионов, но и наличием пока еще не выясненных негативных факторов при культивировании, которые, по-видимому, оказывают отрицательное влияние на развитие эмбрионов, находящихся на разных стадиях, причем наиболее чувствительны ранние и поздние морулы от высокопродуктивных здоровых и проблемных коров-доноров.

Таким образом, методы оценки жизнеспособности по морфологическим признакам не позволяют выявить структурные нарушения эмбрионов, обусловленные метаболическими сдвигами у коров-доноров, вызванными патологическими процессами и/или интенсивностью обмена веществ при высокой продуктивности. Поэтому положительно оцененные по морфологическим признакам эмбрионы следует дополнительно тестировать методом культивирования in vitro, что позволит на 1/3 сократить непроизводительные затраты на трансплантацию нежизнеспособных зародышей.

Л И Т Е Р А Т У Р А

• 1.    К р и в о х а р ч е н к о А.С., В и л ь я к о в и ч Л.И. Хранение яйцеклеток и эмбрионов млекопитающих при положительных и околонулевых температурах. Онтогенез, 1995, 26, 1: 38-45.

• 2.   Г е о р г и е в с к и й В.И. Физиология сельскохозяйственных животных. М., 1990.

• 3.   К а у ф ф о л ь д П., Т а м м И., Ш и х о в И.Я. и др. Оценка качества эмбрионов крупного рогатого

  скота. М., 1990.

• 4.    В о р о н ц о в а П., Т а р а д а й н и к Т., Д р о н и н А. Опыт трансплантации эмбрионов. Молочное и мясное скотоводство, 1988, 3: 19-20.

• 5.    K o j i m a T., S o m a T., O g u r i N. The effects of simplification of donor preparation, several superovulatory treatments by FSH-P and single insemination regimen on embryo production in Japanese beef cattle. Jap. J. Zootehn. Sci., 1989, 60, 8: 721-727.

• 6.    R i h a J., P o l a s e r M., B a n a s P. Vliv veku, plemenne prislusnosti dazkyne a rocniho obdoli na ova-rialni oderzvu po aplikaci PMCG u krav. Zivocina Vyroda, 1985, 30, 3: 217-225.

• 7.    G u s t a f s s o n H. Characteristics of embryos from repeat breeder and virgin heifers. Theriogenology, 1985, 3: 487-489.

• 8.    С е р г е е в Н.И. Биотехнологические приемы в технологии трансплантации эмбрионов. Бюл. науч. тр. ВИЖ. Дубровицы, 1991, 104: 3.

• 9.    Р у р у а У.Г. Периодичность функционирования и гормонопродуцирования фолликулов при культивировании in vitro. Мат. 4-й респ. науч. конф. молодых ученых и специалистов в области животноводства, ветеринарии и экономики сельского хозяйства и 43-й студенческой науч. конф. Тбилиси, 1989: 20-21.

• 10.    К у з ь м и н а Г.И., З а в е р т я е в В.П., Д ж а б б у р З.И. Сезонные изменения оплодотворяемости ооцитов коров при культивировании вне организма Бюл.      ВНИИГРЖ. Л., 1989, 115: 25-26.

• 11.  B i g g e r s B., G e i s e r t R., W e t t e r m a n R. e.a. Effect of heat stress on early embryonic develop

  ment in the beef cow. J. Anim. Sci., 1987, 64, 5: 1512-1518.

• 12.  S n i j d e r s S., D i l l o n P., S r e e n a n J. e.a. Effect of genotype on follicular dynamics and subsequent

  reproductive performance. Irish J. Agricultural and Food Research, 1997, 36: 96.

• 13.    S n i j d e r s S., D i l l o n P., O´ C a l l a g h a n D. Effect of genetic merit, milk yield, body condition and lactation number on in vivo oocyte development in dairy cows. Theriogenology, 2000, 53: 981-989.

• 14.    B u t l e r W., S m i t h R. Interrelationships between energy balance and postpartum reproductive function in dairy cows. J. Dairy Sci., 1989, 72: 767-783.

• 15.    Инструкция по трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота. М., 1987.

• 16.    Методические рекомендации по оценке качества эмбрионов крупного рогатого скота при трансплантации эмбрионов. М., 1986.

• 17.    Эмбрионы крупного рогатого скота. ГОСТ 28424-90. Технические условия. М., 1990.

Всероссийский НИИ животноводства,                       Поступила в редакцию

142132, Московская обл., Подольский р-н, п/о Дубровицы                         13 апреля 2005 года

COMPARATIVE CHARACTERISTIC AND ESTIMATION OF VIABILITY IN EMBRYOS OBTAINED FROM HEALTHY AND PROBLEM COWS-DONORS WITH VARIOUS LEVEL OF DAIRY PRODUCTIVITY

V.A. Anzorov, V.A. Titova, S.N. Khil’kevich, V.M. Shiriev, N.I. Sergeev, F.N. Nasibov, E.U. Baitlesov

S u m m a r y

In comparative aspect the authors analyze the morphological peculiarities embryos obtained from healthy and problem (functional disorder of reproductive system as a result of chronic stressor action) cows-donors with various level of dairy productivity and also discuss a trustworthiness of present methods for estimation of embryo’s viability. It was shown, that the methods for estimation of embryo’s viability on morphological determinants do not permit to reveal the metabolic changes induced by pathological process and/or intensive metabolism owing to high productivity. Therefore, the positive estimated on morphological determinants embryos must be extra tested by cultivation in vitro, that permit to cut down of 1/3 expenses on transplantation of nonviable embryos.

Новые книги

Вирусные и ассоциативные вируснобактериальные респираторные болезни крупного рогатого скота. (Особенности эпизоотологии, патогенеза, клинического проявления, патолого-анатомических изменений). Метод. реком. /Подг. А.Г. Глотов, Н.А. Шкиль, Т.И. Глотова и др. Новосибирск, 2004, 28 с.

В рекомендациях рассматриваются наиболее актуальные с точки зрения эпизоотологии и экономического ущерба для животно- водства вирусные респираторные заболевания крупного рогатого скота (инфекционный ри-нотрахеит, пустулезный вульвовагинит, вирусная диарея, болезнь слизистых оболочек, паро-грипп-3 крупного рогатого скота). Описаны симптомы «классического» проявления болезней. Отражены особенности эпизоотического процесса, патогенеза, клинического проявления, патологических изменений при вирусных и ассоциативных вирусно-бактериальных респираторных инфекциях.