Сравнительное исследование образования двунитевых разрывов ДНК в клетках линии РС3 (рака предстательной железы человека) при воздействии гамма излучения сверхвысокой и терапевтической мощности дозы

В настоящее время показано, что, наряду с такими параметрами как доза, фракционирование, большое влияние на биологическую эффективность фотонного излучения (более традиционный термин – гамма излучение) оказывает такой параметр, как мощность дозы излучения, т.е. плотность излучения во времени, или, другими словами, доставляемая энергия в единицу времени. Эффект мощности дозы хорошо изучен в диапазонах от низких (0,01 Гр/мин) [12] до средних мощностей доз (10-100 Гр/мин) [3, 10]. Общей закономерностью является увеличение ОБЭ при увеличении мощности дозы. Однако эффекты не всегда пропорциональны мощности дозы и могут иметь участки с отрицательным наклоном, т.е. может наблюдаться снижение биологических эффектов при увеличении мощности дозы. Кроме того, практически открытым остается вопрос биологических эффектов сверхвысоких мощностей доз (ultra-high dose rate) – диапазон мощностей выше 108 Гр/мин. Это связано, прежде всего, с отсутствием экспериментальных установок, обладающих необходимыми характеристиками. Имеющиеся публикации приводят противоречивые результаты, в то время как теоретические расчеты позволяют предположить, что при переходе на сверхвысокие мощности дозы могут иметь место принципиальные отличия радиоиндуцируемых молекулярных процессов. Из расчета, что средняя энергия фотона медицинского ускорителя с мощностью до 1 кВт составляет порядка 1 МэВ, в клетке с диаметром ~10 мкм усредненно поглощается 10 фотонов в секунду. Таким образом, акты первичного взаимодействия фотонов с внутренней средой клетки отделены промежутком времени 1 – 10 мс, а за счет появления деградационного спектра вторичных электронов это время сокращается в несколько десятков раз. Увеличение мощности дозы до величин 108 Гр/мин и более приводит к увеличению, соответственно, плотности свободных электронов и числа возникающих радикалов в клетке в миллионы раз, что может привести к качественным изменениям реакции клетки на облучение. Возможно также развитие нелинейных эффектов в клетке с множественными, одновременно образующимися повреждениями ДНК. Ранее мы показали, что облучение клеток человека фотонным излучением сверхвысокой мощности дозы приводит к качественным изменениям показателей их гибели (изменение соотношения гибели клеток по пути апоптоза или некроза) [2]. В настоящей работе мы исследовали частоту двойных разрывов в клетках рака предстательной железы человека. Этот показатель отражает не только физические и физико-химические молекулярные процессы, индуцируемые ионизирующим излучением, но и состояние репарационных систем в клетке, что может быть принципиальным при выборе оптимальных режимов облучения в программах лучевой терапии в онкологии.

Цель работы:

Исследование эффекта мощности дозы на образование ДНР ДНК в клетках линии рака предстательной железы человека РС3.

Материалы и методыОблучение клеток на экспериментальной установке «МИР-М»

Установка «МИР-М» представляет собой сильноточный наносекундный ускоритель электронов с выходной энергией до 800 кВ и длительностью импульса 40-60 нсек на полувысоте. Мишенью анодного узла является танталовая фольга толщиной 50 – 100 мкм. Для поглощения прошедших через фольгу электронов используется дополнительный фильтр из углеродного композита толщиной 1 мм. Мощность дозы установки «МИР-М» составляет 109 – 1010 Гр/сек.

В работе для дозиметрии использовались термолюминисцентные дозиметры (ТЛД) ДТГ-4 (НПП «Доза», Россия). Оценка поглощенной дозы проводилась с помощью измерения облученных дозиметров на комплексе «ДОЗА-ТЛД» (НПП «Доза», Россия). Для более точной дозиметрии использовались дозиметрические пленки Gafchromic EBT2 (Ashland, США) с погрешностью оценки дозы не более 1%. Образцы клеток облучали в культуральных флаконах по методикам, описанным в [1].

Облучение клеток на гамма-терапевтической установке «Рокус-АМ»

«Рокус-АМ»-   представляет собой терапевтическую гамма-установку, использующуюся в клинической практике при лучевой терапии опухолей различных локализаций. Источником излучения служит кобальт-60 (Со-60). В данном исследовании «Рокус-АМ» использовался для сравнительной оценки излучения малой мощности с высокоинтенсивным гамма-излучением. Мощность дозы терапевтических гамма-установок составляет 0,9 Гр/мин (15 мГр/сек), т.е. в 109 – 1010 раз уступает мощности наносекундных ускорителей.

Параметры облучения: расстояние источник-поверхность (РИП) 75 см, поле 10 × 10 см. Облучение производилось со смещением по времени в 1 – 1,5 часа относительно времени облучения на установке сверхинтенсивного гамма-излучения.

Работа с культурами клеток

В качестве биологической модели использованы клетки перевивной культуры РС3 (рак предстательной железы человека, коллекция Cell Lines Service (Human Prostate Adenocarcinoma, 300312)).

Перед культивацией клетки подвергали разморозке и отмывке:

• 1.    Клетки в виале быстро размораживали в инкубаторе при 37˚С.

• 2.    Размороженную клеточную суспензию помещали в 15 мл полной ростовой среды

• 3.    Центрифугировали 8 мин при 300 g.

• 4.    Сливали среду, осадок ресуспендировали в 5 мл среды DMEM c 15% содержанием

DMEM с 20% фетальной бычьей сыворотки (FBS), осторожно перемешивали.

FBS и засевали клетки во флакон.

Клетки культивировали с использованием среды DMEM (ПанЭко, Россия) с 10% содержанием фетальной бычьей сыворотки (ПанЭко, Россия) и добавлением антибиотика гентамицина во флаконах Tissue Culture Flask (Sarstedt, Германия); в условиях 5% CO 2 и 37⁰ С. Пересев осуществляли каждые 4 – 5 дней. Для снятия клеток с адгезивного дна флакона и их пересева использовался раствор трипсина (ПанЭко, Россия). Мониторинг состояния клеточных культур осуществлялся с помощью микроскопа MСХ300 (Micros, Австрия).

Цитофлуорометрический анализ проводился на проточном цитофлуориметре Beckman Coulter (USA), источник излучения – аргоновый лазер (λ=488 нм). Исследование количества ДНР ДНК проведено на основании оценки уровня фосфорилирированного гистона Н2АХ с помощью набора фирмы Millipore (17-344 H2A.X Phosphorylation Assay Kit (for Flow Cytometry)), анализ проводился согласно методике производителя.

Количество ДНР оценивалось по смещению положения пика флуоресценции (Рис. 1) относительно положения пика в контрольных необлученных образцах.

Overlay Plot 1

Рисунок 1. Пример изменения интенсивности флуоресценции в образцах клеток культуры РС-3 после воздействия высокоинтенсивного рентгеновского излучения по сравнению с контролем (красный пик) (облучение в дозе 0 Гр).

Результаты и обсуждение

Образование ДНР является одним из ключевых моментов повреждающего действия ионизирующего излучения на клетку. Как показано в большом количестве исследований [8, 9, 12], во многом, именно уровень ДНР определяет дальнейшую судьбу клетки: запуск систем репарации, остановка деления, индукция апоптоза и др. Таким образом, количество радиоиндуцированных ДНР можно рассматривать как показатель повреждающего воздействия ионизирующего излучения [7].

На рисунке 2 представлены зависимости относительного уровня ДНР в клетках рака предстательной железы человека РС3 от дозы при двух режимах облучения.

Рисунок 2. Относительный уровень ДНР ДНК в культуре клеток рака предстательной железы человека РС3. Красные квадраты показывают количество ДНР при облучении на гамма-терапевтическом аппарате Рокус М, синие ромбы – при облучении на экспериментальной установке «МИР-М» со сверхвысокой мощностью дозы.

Приведенные результаты показывают принципиальное отличие при воздействии гамма излучения, имеющего терапевтическую мощность дозы, и гамма излучения со сверхвысокой мощностью дозы. Тогда как увеличение дозы при облучении на терапевтическом гамма аппарате приводит к линейному росту числа ДНР, облучение при сверхвысокой мощности дозы приводит к резкому увеличению количества ДНР уже при дозах 2 – 3 Гр, и при возрастании дозы число ДНР продолжает увеличиваться. При этом количество ДНР растет нелинейно. Общее количество ДНР на клетку при воздействии сверхвысокой мощности дозы в 5 – 6 раз выше, по сравнению с количеством, образуемым при облучении с низкой мощностью дозы при дозах выще 10 – 12 Гр.

При терапевтической мощности дозы 1,5 – 2 Гр/мин в клетке с характерным размером ~ 10 мкм усреднено поглощается ~ 100 квантов в секунду с энергией ~ 100 кэВ. Таким образом, акты воздействия отделены временем 1 – 10 мсек. Репарационные процессы в клетке, идущие с более коротким временем, должны успевать устранять повреждения. Значительное увеличение интенсивности дозы, достигнутое на установке «МИР-М», сокращает время между последовательными актами взаимодействия излучения на 6 – 7 порядков величины, что приводит к изменению реакции клетки на облучение. Возможно также, что увеличение числа ДНР связано с наличием/развитием нелинейных эффектов в клетке с множественными одновременно образующимися повреждениями. Отличия в уровне ДНР, полученные при облучении клеток линии РС3 на установке «МИР-М», могут быть связаны как с процессами образования ДНР, так и с эффективностью работы систем репарации в клетке. Недостаточность, неэффективность репаративных механизмов в опухолевых клетках показана в ряде экспериментальных исследований [4, 11], также отмечается, что эффективность репарации зависит как от типа и интенсивности воздействия, так и от функциональных особенностей клеток [6]. При облучениях, характеризующихся высокой мощностью дозы, параметры радиочувствительности клеток меняются, возрастает количество остаточных, нерепарированных ДНР [5, 9]. Мы ранее показали, что разные линии клеток злокачественных опухолей человека обнаруживают неодинаковую реакцию при воздействии фотонного облучения сверхвысокой мощности [2]. Таким образом, можно предположить, что вклад эффекта мощности дозы в повреждение клетки определяется, в первую очередь, состоянием системы репарации. Поиск эффективных методов оценки прогноза чувствительности к параметрам фотонного излучения имеет принципиальное значение при разработке методов клинического применения излучения высокой мощности дозы [8]. Полученные нами результаты позволяют высказать предположение о перспективности исследований гамма излучения со сверхвысокой мощностью дозы для возможного его дальнейшего применения в лучевой терапии злокачественных опухолей.

Исследование выполнено при поддержке проекта РНФ № 16-15-10355.