Условия хранения концентрата тромбоцитов в учреждениях службы крови (обзор)

Введение. В качестве альтернативы широкому применению консервированной крови в настоящее время в клинической трансфузиологии широко применяется компонентная гемотерапия. Дифференцированное использование различных компонентов крови, в зависимости от их дефицита при тех или иных заболеваниях, дает возможность не только повысить эффективность гемотерапии, но и более рационально использовать ресурсы донорской крови. К числу наиболее востребованных компонентов крови относится концентрат тромбоцитов (КТ). Переливание КТ является необходимой мерой коррекции тромбоцитопении, в первую очередь, в онкологической и гематологической практике [1]. Так возможность трансфузии донорских тромбоцитов во многом определяет успех пересадки костного мозга гематологическим больным, а также эффективность лечения онкологических пациентов после применения агрессивных видов химио- и лучевой терапии, вызывающих угнетение процессов образования собственных тромбоцитов. Трансфузии КТ могут быть назначены не только в терапевтических целях, но и для профилактики интенсивных кровотечений у больных с тромбоцитопенией любой этиологии [2].

Несмотря на высокую клиническую потребность в КТ, адекватное обеспечение пациентов тромбоцитами представляет определенные сложности для службы крови и для врачей клинической практики. Это связано как с объективными свойствами самого компонента – коротким сроком хранения (до 5 суток), длительностью приготовления (до двух рабочих дней с учетом сроков апробации), так и с вероятностью быстрого развития у пациентов клинически значимой тромбоцитопении. Высокая себестоимость лимитирует создание достаточного запаса КТ необходимых групп крови, а непредсказуемость развития тромбоцитопении создает трудности для расчета потребности каждого пациента в этом компоненте. В связи с этим определение возможностей улучшения процедур заготовки КТ, а также способов поддержания функциональной активности тромбоцитов, позволяющих увеличить срок их хранения, является одной из приоритетных задач современной трансфузиологии [3]. Создание адекватной среды для хранения выделенных тромбоцитов рассматривается как одна из возможностей повышения качества КТ и увеличения срока годности компонента.

Цель исследования. Выявить перспективный подход к условиям хранения тромбоцитного концентрата для повышения эффективности и безопасности трансфузий КТ.

Материалы и методы. Использованы ресурсы поисковых систем Pub Med и РИНЦ. Особое внимание уделено условиям хранения и активации тромбоцитов в КТ.

Результаты и обсуждение. Исследования, посвященные поиску сред для сохранения тромбоцитов, начались за рубежом в конце 80-х – начале 90-х годов прошлого века [4, 5]. Первоначально тромбоциты заготавливали с использованием 100% собственной плазмы крови донора [6, 7]. Однако переливаемая в составе тромбоцитов плазма может являться причиной гемолитических осложнений, аллергических и анафилактических реакций, острого поражения легких, быть источником гемотрансмиссивных инфекций [7, 8, 9]. В связи с этим были предприняты попытки снизить содержание плазмы в консервирующем растворе путем ее разведения. В числе первых добавочных растворов вместо плазмы крови был использован 0,9% изотонический раствор натрия хлорида [10]. Было установлено, что при замещении плазмы изотоническим 0,9% раствором натрия хлорида функциональная активность тромбоцитов сохранялась лишь в течение первых суток их хранения. Снижение жизнеспособности тромбоцитов в этих экспериментах объяснялось быстрым истощением энергетических ресурсов клеток, связанным с недостаточным содержанием в окружающей среде компонентов, необходимых для восполнения дефицита АТФ. В дальнейшем исследователями осуществлялся поиск оптимального соотношения плазмы и добавочного раствора в среде для хранения тромбоцитов, а также состава используемого раствора. По результатам экспериментальных исследований были предложены растворы для хранения тромбоцитов, представляющие собой смесь плазмы (20-50%) и добавочного (ресуспендирующего) раствора (50-80%).

Как показали исследования, использование добавочных растворов в сравнении с применением нативной плазмы позволяет получить значительные преимущества. Так уменьшение количества плазмы, переливаемой вместе с тромбоцитами, позволяет сохранить плазму в качестве сырья для производства лечебных препаратов [11]. Наряду с этим, появляется возможность трансфузии не идентичных по группе крови тромбоцитов с более низким титром гемоагглютинации, что минимизирует частоту посттрансфузионных реакций [7]. Снижение количества плазмы в КТ дает возможность его фотохимической обработки для инактивации бактерий и других патогенов с использованием современных методик [11, 12]. Кроме того, возможно улучшение условий хранения и сохранение функциональных свойств тромбоцитов [4, 5, 10, 13].

Важным аспектом использования добавочных растворов является возможность включения в состав компонентов, которые не присутствуют в плазме или в антикоагулянтах и имеют специфическое воздействие на тромбоциты. По мнению исследователей, уменьшение активации тромбоцитов и улучшение их метаболизма и функции путем включения ключевых компонентов в среду для хранения тромбоцитов – инструменты для оптимизации условий хранения тромбоцитов [4, 10].

В последние десятилетия проводятся активные исследования по изучению метаболизма тромбоцитов во время их хранения в различных растворах [1, 13, 14]. Ученые осуществляют поиски средств, способных целенаправленно поддерживать метаболизм и предотвращать активацию тромбоцитов. В состав экспериментальных растворов последнего поколения некоторые исследователи включают глюкозу, поскольку выяснено, что в средах, содержащих количества плазмы ниже 15-20%, количество присутствующей глюкозы становится слишком низким для поддержания метаболизма тромбоцитов при хранении в течение нескольких дней. Однако добавление глюкозы создает ряд проблем технологического характера, связанных с нестабильностью и карамелизацией глюкозы при стерилизации автоклавированием при физиологических значениях рН. Присутствие ацетата натрия в добавочном растворе существенно стабилизирует уровень рН [15]. Ацетат снижает продукцию лактата и повышает потребление тромбоцитами кислорода. Однако высокие концентрации ацетата ассоциируются с повышением активации тромбоцитов и снижением их жизнеспособности [16]. Фосфаты могут действовать на тромбоциты во время их хранения двумя путями – как буфер, предотвращающий падение значения рН, и как вещество, стимулирующее гликолиз и повышающее продукцию лактата.

Исследователи активно обсуждают роль добавляемых в растворы ионов калия и магния и изучают их влияние на тромбоцитарную активность в зависимости от концентраций этих ионов в среде [17, 18]. Присутствие в добавочном растворе ионов магния значительно ингибирует экспрессию Р-селектина, снижает присоединение фибриногена к активированным АДФ тромбоцитам и существенно уменьшает активацию тромбоцитов [18]. В литературе также обсуждается целесообразность присутствия в растворах ионов кальция [7, 18, 19]. С одной стороны, ионы кальция, как известно, активируют агрегацию тромбоцитов во время их хранения, поэтому их присутствие нежелательно. С другой – добавка кальция, как было показано, улучшает метаболизм тромбоцитов и их клеточные характеристики, поскольку поддерживает проходимость ионов калия через мембрану тромбоцита.

Ряд исследователей обосновывает необходимость присутствия бикарбоната, поскольку этот компонент ингибирует падение рН, вызванное продукцией лактата [7]. При хранении тромбоцитов в условиях 2% плазмы в присутствии бикарбоната значение рН повышалось к 3 дню до 7,04, к 5 дню – до 7,39. Это повышение могло быть связано с увеличением содержания бикарбоната из-за прекращения продукции лактата к 3 дню, что показывает, по мнению авторов, важность присутствия бикарбоната в среде хранения тромбоцитов [7]. Раствор, содержащий бикарбонат и глюкозу, предупреждал развитие аллергических реакций без потери эффективности трансфузий детям с гематологическими и злокачественными заболеваниями [20].

В настоящее время КТ принято хранить в газопроницаемых контейнерах при температуре от 20ºС до 24ºС с постоянным покачиванием в течение 5-7 дней. В некоторых странах назначен срок хранения тромбоцитов не более 5 дней для снижения риска бактериальной контаминации, которая способна вызвать сепсис после трансфузии. Очевидно, хранение тромбоцитов при температуре около 4ºС в холодильнике потенциально может в значительной степени уменьшить бактериальный рост.

Известно, что тромбоциты, хранящиеся в холодильнике, сохраняют гемостатическую активность и успешно применялись ранее для лечения пациентов с активными кровотечениями. Однако низкие температуры значительно уменьшают выживаемость тромбоцитов при использовании in vivo [21-23]. После хранения в течение 24 часов при 4ºС тромбоциты претерпевают обязательную потерю микротубул с повторным образованием цитоскелета, образуют сферическую форму, формируют псевдоподии, что приводит к снижению ответа на гипотонический шок. Продолжающееся хранение при 4ºС ингибирует агрегационный ответ и активирует тромбоциты [24, 25].

Многие изменения, вызванные хранением тромбоцитов при 4ºС, можно частично купировать согреванием не позже, чем после 18 часов хранения. Более того, температурный цикл, состоящий из 12 часов хранения при 4ºС и 30 минут при 37ºС, позволяет вновь получить микротубулы и, частично, дискоидную форму тромбоцитов. Тромбоциты, хранившиеся при таких условиях в течение до 7 дней, сохраняли способность к агрегации и давали лучший ответ на гипотонический шок по сравнению с тромбоцитами, хранившимися как при 4ºС, так и при 20-24ºС [26].

Следует учесть, что в банках крови практически невозможно мануальное перемещение тромбоцитов между инкубациями при 4ºС и 37ºС. Было проведено исследование тромбоцитов, хранившихся в инкубаторах, запрограммированных на циклы: 11 часов при 5ºС, затем 1 час при 37ºС. Одиннадцатичасовое исследование было выбрано для автоматизации циклических условий, которые позволили бы дополнительному таймеру для покачивания действовать циклически в фазе, чтобы цикл инкубации не нуждался в дальнейшем репрограммировании. Идентичные аликвоты тромбоцитов хранились при трех различных условиях: при 20-24ºС с постоянным покачиванием, при 4ºС без покачивания, с температурным циклом с временным покачиванием при нагревании [21]. В результате исследования оказалось, что тромбоциты, хранившиеся с использованием меняющегося температурного цикла, показали лучшие характеристики in vitro. Согревание тромбоцитов в течение часа после каждого холодного периода повышало гликолиз и потребление кислорода в сравнении с тромбоцитами, хранившимися при 4°C. Тромбоциты, хранившиеся при меняющемся температурном цикле, не полностью теряли дискоидную форму в течение 7 дней хранения и показали более низкие уровни маркеров апоптоза по сравнению с тромбоцитами, хранившимися при других условиях. Однако они не отличались от тромбоцитов, хранившихся как при 20-24°C, так и при 4°C, по степени жизнеспособности in vivo в эксперименте на животных. Необходимы клинические испытания для окончательного вывода о преимуществе тромбоцитов, хранившихся с использованием меняющегося температурного цикла.

Исследования in vitro показали, что тромбоциты, хранящиеся при комнатной температуре, функционально и метаболически превосходят тромбоциты, хранящиеся при 4°C [27, 28]. С другой стороны, ряд исследований доказывают, что хранившиеся при 4°C тромбоциты образуют более крепкий сгусток и снижают время кровотечения как у пациентов с тромбоцитопенией, так и у волонтеров, принимавших ацетилсалициловую кислоту [29]. По таким показателям, как число тромбоцитов, клеточная морфология, состояние мембраны, цитоплазматическая структура, скорость агрегации, гемостатическая функция, тромбоциты, хранящиеся при 4°C от 10 до 14 дней, были лучше, чем хранившиеся при 22°C в течение 5 дней [30].

Практика переливания тромбоцитов, хранившихся при 4°C, была отменена в 70-х годах прошлого века из-за снижения прироста тромбоцитов и их жизнеспособности по сравнению с тромбоцитами, хранившимися при комнатной температуре [31, 32]. В клиническом исследовании здоровых волонтеров сравнивались радиомеченые аутологичные полученные аферезом тромбоциты, хранившиеся в течение 7 дней при комнатной температуре и на холо- де. Выяснилось, что тромбоциты, хранившиеся при комнатной температуре, были эффективнее в in vivo циркуляции, чем хранившиеся на холоде [33]. Однако имеются данные о том, что тромбоциты, хранившиеся при 4°C, циркулируют и снижают время кровотечения так же эффективно, как и тромбоциты, хранившиеся при комнатной температуре [34]. Проводятся исследования тромбоцитов разного срока хранения. Исследования более 4000 онкогематологических больных показали, что время до следующей необходимой трансфузии ТК укорачивается с повышением срока хранения введенных больному тромбоцитов [35]. С увеличением продолжительности хранения КТ возрастала частота воспалительных побочных реакций. Бактериальная контаминация КТ повышается к 6-му и 7-му дням хранения до 54% [36, 37].

Учитывая вышесказанное, многим ученым кажется предпочтительным холодное хранение КТ или его замораживание с диметилсульфоксидом, которое продлевает жизнь тромбоцитов на недели и месяцы [38, 38]. Чтобы быть клинически эффективными, тромбоциты должны функционировать и вернуться в циркуляцию после трансфузии. Возмещение in vivo и выживаемость – золотой стандарт в оценке тромбоцитов – не оценивает функцию тромбоцитов. Ни один из тестов in vitro не коррелирует с возмещением и выживаемостью тромбоцитов, хотя они и дают важную информацию о физиологии тромбоцитов и степени убывания их функций во время хранения [40, 41].

Появились исследования, посвященные изучению различий метаболизма тромбоцитов при разных условиях хранения [42, 43]. При проведении исследований по изучению метаболизма тромбоцитов ученые уделяют внимание поиску средств, способных целенаправленно поддерживать метаболизм и предотвращать активацию тромбоцитов.

В первые периоды пандемии в 2019 году имели место серьезные опасения по поводу нехватки компонентов крови [44, 45]. В США было получено несколько экстренных разрешений на продление срока годности КТ с использованием холодового хранения. В феврале 2020 года Техасский центр крови и тканей получил лицензию на производство и распространение тромбоцитов, хранящихся в холоде в течение 14 дней. Кроме того, в клинике Майо в Рочестере па-тоген-инактивированные тромбоциты после 5 дней хранения разрешили перевести в холодовой режим еще на 9 дней. В общей сложности 61 единица этих отложенных тромбоцитов, хранящихся в холодильнике, была перелита 40 пациентам. Большинству этих пациентов были сделаны операции на сердце. Результаты этих переливаний показали, что у реципиентов наблюдался адекватный гемостаз, сопоставимый с данными пациентов, получавших тромбоциты, хранящиеся в регламентированных условиях. Также не было задокументированных трансфузионных реакций, связанных с переливанием тромбоцитов, хранящихся в холодильнике [46]. Сохранность функциональной способности тромбоцитов, общий объем трансфузий, количество посттрансфузионных реакций и осложнений, продолжительность пребывания в отделении интенсивной терапии и летальность были сопоставимы между пациентами, получавшими КТ, при использовании двух разных условий хранения [47].

В добавлении к вышесказанному отметим, что изучение микрочастиц может быть эффективным инструментом в процессе оценки качества КТ и ожидаемого эффекта его применения. Существенно расширяются диагностические возможности для оценки качества тромбоцитов на основании определения значимого маркера активации тромбоцитов - микрочастиц тромбоцитарного происхождения, циркулирующих микрочастиц (при использовании антител против антигенов СD41/61 или CD42b). Микрочастицы благодаря своему строению и биохимическому составу могут участвовать в передаче разнообразных активирующих стимулов при развитии иммунного ответа, воспалительных реакций и тромботических состояний [48-50]. Микрочастицы, образовавшиеся в результате хранения, связаны с повышенной агрегацией тромбоцитов и модуляцией иммунной системы. Обращает на себя внимание участие тромбоцитарных микрочастиц в иммунологических реакциях с опосредованной продукцией провоспалительных цитокинов и липидных медиаторов. Более того, повышенное содержание тромбоцитарных микрочастиц в КТ свидетельствует о менее продолжительной жизни и циркуляции донорских тромбоцитов в кровяном русле реципиента. В большинстве случаев увеличение микрочастиц является следствием и маркером внутрисосудистой активации тромбоцитов. Однако немаловажным фактором является их возможная роль в развитии трансфузиологических осложнений за счет потенциального провоспалительного эффекта в присутствии иммуноглобулина и компонентов комплемента.

Большой интерес вызывает изучение количества микрочастиц в КТ в связи с клинической эффективностью тромбоконцентрата. Перспективным для оценки качества лейкоредуцированного КТ является определение в нем концентрации микрочастиц. Однако трансфузии КТ, содержащих большое количество микрочастиц, могут быть клинически неэффективны [51]. Для профилактических переливаний онкогематологическим пациентам, важна длительность циркуляции тромбоцитов в кровотоке для снижения количества трансфузий и, соответственно, снижения аллоиммунизации и посттрансфузионных осложнений. Этим целям, на данный момент, больше соответствует КТ в добавочном растворе лейкоредуцированный, патоген-инактивированный, хранящийся при регламентированной нормативными документами температуре (22±2°C) при непрерывном помешивании, содержащий, вероятно, меньшее количество микрочастиц.

Заключение. Успех заместительной терапии во многом определяется функциональным состоянием переливаемых тромбоцитов. Качество тромбоцитов зависит от способа их приготовления и условий хранения, включая среду хранения, продолжительность хранения, тип контейнера. Поиску оптимизированного состава среды хранения, способной поддерживать функциональное состояние тромбоцитов в условиях их длительного хранения, посвящены многие отечественные и зарубежные исследования. Используемые в настоящее время в мировой практике среды хранения содержат 30-40% донорской плазмы и 60-70% добавочного (ресуспендирующего) раствора. Как показывает анализ литературы, одно из направлений улучшения качества среды хранения включает попытки исследователей максимально снизить содержание плазмы (вплоть до 8-2%), что повышает безопасность использования КТ для реципиента. Однако хранение тромбоцитов в таких условиях значимо сокращает сроки жизни клеток, что связано с низким содержанием в среде хранения КТ метаболитов, необходимых для поддержания жизнедеятельности тромбоцитов.

Одним из факторов, определяющих качество тромбоцитов, является температурный режим хранения клеток. Наиболее эффективным считается хранение КТ при температуре +20-24°C с постоянным покачиванием. Разрешенный срок хранения КТ в таких растворах составляет от 5 до 7 дней. Однако при указанной температуре возникает риск бактериальной контаминации компонента крови. Для подавления бактериального роста исследователи изучали возможность хранения КТ в холодильнике при температуре +4°C. Показано, что низкие температуры ингибируют агрегационные свойства тромбоцитов и снижают их выживаемость. Для предотвращения этих процессов разработаны методы хранения КТ с использованием попеременно меняющегося температурного цикла (инкубация при температуре +4°C и +37°C). При испытании метода в условиях in vitro получены обнадеживающие результаты. Однако для окончательного вывода необходимо подтверждение этих данных в клинических условиях.

Известно, что физиологический срок жизни тромбоцитов не превышает 7–10 дней. Исходя из этого, долгосрочное хранение этого гемокомпонента может осуществляться лишь в условиях замораживания. По результатам исследования эффективности криоконсервирования КТ установлено, что после замораживания клеток при температуре как –30°C, так и –80°C сохраняется не менее 83% функционально активных клеток. Внедрение этого метода в широкую практику также, возможно, позволит решить многие организационные трудности обеспечения растущих потребностей клиницистов в лечебных дозах тромбоцитов.

Для проведения рутинного скрининга концентратов тромбоцитов требуется быстрый и простой неинвазивный тест, который оценивает характеристики тромбоцитов, имеющие значение для всех аспектов качества тромбоцитов. При переливании крови больным с онкологическими заболеваниями или перенесшими внутреннее кровотечение, активные тромбоциты представляют опасность, и поэтому требуются концентраты с минимальным содержанием микрочастиц. Измеряя состав концентрата тромбоцитов, содержание микрочастиц можно определить характеристики компонента при хранении, устойчивость к дополнительным нагрузкам и обосновать его оптимальное использование.