Влияние источника углерода на накопление биомассы целлюлозолитических микроорганизмов - продуцентов кормовой добавки

Рост и размножение биомассы микроорганизмов в рубце происходит лишь при оптимальных условиях: рН (6,3-6,8 близкой к нейтральной), постоянной температуре (39-40°С), определенном газовом составе (низкое содержание кислорода – анаэробиоз) [1].

Внастоящеевремяразработанобольшоеколичестворазнообразных сред для культивирования целлюлозолитических микроорганизмов. Они могут содержать различные компоненты: синтетические, естественно-биологические или их сочетание [2,3,4,5,6]. Среда должна обеспечивать культуры всеми необходимыми питательными компонентами, способствовать быстрому накоплению микробной массы и обеспечивать сохранение свойств культур.

Углерод. Входит в состав органических соединений, образующих клеточную стенку, а также в состав цитоплазмы. Углерод составляет 40...60% сухого веса микробной клетки.

Водород. Структурный и функциональный элемент. Входит в состав всех органических соединений. В грибной клетке содержится 6...8% от веса сухого мицелия. Входит в состав свободной и связанной воды.

Азот. Входит в состав белков. Микроорганизмы испытывают потребность в аммонийном или аминном (органическом) азоте, также могут быть высоко чувствительны к недостатку азота [7,8,9].

Сера. Входит в состав серосодержащих аминокислот, таких как метионин, цистеин, ферментов, тиамина, биотина. Положительное влияние серы на рост показан в ряде опытов [10,11].

Фосфор. Является компонентом ДНК, РНК, АТФ. АТФ -нуклеозидтрифосфат имеющий большое значение в обмене энергии и веществ в организмах, универсальный источник энергии для всех биохимических процессов, протекающих в живых системах, в частности для образования ферментов. Источниками фосфора в питательных средах могут быть органические и минеральные соединения[12].

Железо. Входит в состав ферментов, важных для метаболизма: цитохромов, цитохромоксидаз, каталазы и др.

Магний (сернокислый магний). Энергия связывания фосфатных групп с активными центрами ферментов снижает энергию активации и увеличивает специфичность ферментативных реакций.

Сахар. Важным источником питания являются углеводные субстраты, в частности целлюлоза - линейный гомополимер состоящий из сотен или десятков тысяч остатков D-глюкозы. Сложное строение делает ее доступной для утилизации только микроорганизмами обладающими определенным набором ферментов. Наличие ее в питательной среде обеспечивает сохранение активности целлюлозолитических микроорганизмов и, являясь единственным источником углеводов, может препятствовать росту других микроорганизмов [13,14].

Важность поддержания буферности растворов (рН). Буферные растворы - растворы с определённой устойчивой концентрацией водородных ионов, рН которых мало изменится при прибавлении к ним небольших количеств сильного основания или сильной кислоты, а также при разбавлении и концентрировании. При добавлении в систему сильной кислоты, она протонирует основание, входящее в буферную смесь, а добавление сильного основания связывает протоны и смещает второе равновесие в сторону продуктов, при этом в итоге концентрация Н + в растворе меняется незначительно. Такие смещения происходят при жизнедеятельности микроорганизмов [15,16].

Таким образом, важным является подбор компонентов среды обеспечивающих оптимальные условия для накопления микроорганизмов.

Материалы и методы

Нами была изучена эффективность накопления микробной массы у тестируемых культур в жидких питательных средах, отличающихся по источнику углерода:

• -    среда Гетчинсона, содержащая в качестве источника углерода карбоксиметилцеллюлозу, состав среды (г/л): K2HPO4 — 1,0; СaCl2*4 H2O — 0,1; MgSO4*H2O — 0,3; NaCl — 0,1; FeCl*6H2O — 0,01; NaNO3 — 2,5; агар-агар — 20,0; дистиллированная вода; рН среды — 7,2-7,3, КМЦ 1%;

• -    питательная среда на основе среды Гетчинсона, содержащая рубцовый фильтрат в количестве 10% и в качестве источника углерода - лактозу 2% (легкодоступный источник);

• -    питательная среда, на основе среды Гетчинсона с рубцовым экстрактом до 10% и содержащая в качестве источника углерода КМЦ 1% (труднодоступный источник) и лактозу 2% (легкодоступный источник).

Оценена активность нарастания микробной массы у 19 штаммов, посуточно, с применением спектрофотометра. Измерение оптической плотности суспензии клеток осуществляли с помощью спектрофотометра ПЭ - 5400УФ (Россия) в кювете с длиной оптического пути 10 мм при длине волны света 550 нм (ОП550), выражали в единицах оптической плотности. Измерения проводили ежедневно в течение пяти дней. Изменение оптической плотности через определенные интервалы времени позволило характеризовать их рост в заданных условиях культивирования, с определением стадии роста культуры.

Турбидиметрия характеризуется быстротой и отсутствием негативного воздействия на клетки, так же является наиболее распространенным аналитическим инструментом для мониторинга роста чистых бактериальных культур [17,18,19,20].

Концентрация микроорганизмов на спектрофотометре определяется по оптической плотности. Она обусловлена поглощением света биологическими молекулами (белками, нуклеиновыми кислотами, липополисахаридами), входящими в состав клеток, и светорассеянием клеток в видимом диапазоне.

В диапазоне от 400 до 900 нм спектр поглощения напрямую зависит от концентрации клеток микроорганизмов в суспензии.

При длине волны 500-650 нм поглощение света компонентами клеток практически отсутствует, и оптическая плотность суспензии клеток обусловлена только светорассеянием. Оптическая плотность, измеренная в этом диапазоне, отражает концентрацию клеток микроорганизмов в суспензии. Оптическая плотность (OD) используется в качестве быстрого косвенного измерения концентрации взвешенной биомассы. Фактически, измерение OD является наиболее распространенным измерением, используемым в микробиологических лабораториях для оценки роста микроорганизмов. OD часто используется для определения стадии роста при индукции культуры, инокуляции. Оптическая плотность напрямую коррелирует с биомассой (закон Бира-Ламберта), таким образом, OD может использоваться для мониторинга биомассы клеток. [21,22,23].

Результаты исследований

Результаты исследований по оценке эффективности для культивирования питательной среды, содержащей труднодоступные углеводы визуализированы в тепловой карте прироста: цветовая шкала позволяет быстро и наглядно оценить эффективность роста микроорганизмов в различных условиях. Цветовое кодирование процента прироста для каждого штамма и каждого дня позволяет отследить общие закономерности и аномалии.

Таблица 1 – Оценка эффективности накопления микробной массы в среде Гетчинсона с КМЦ 1% (тепловая карта)

№ штамма	День 2    День 3      День 4      День 5 Процент прироста микробной массы
1	17,6	15,0	17,4	9,8
2	12,9	52,4	-10,7	14,3
3	22,0	6,7	6,3	8,9
4	2,20	2,0	4,2	8,1
5	29,7	9,8	0,0	4,4
6	15,0	22,6	38,4	5,5
7	12,0	3,6	19,2	20,0
8	45,0	69,0	2,8	9,8
9	17,0	0,0	0,0	13,9
10	8,0	8,1	22,6	20,0
11	17,0	42,5	31,3	5,6
12	54,0	12,2	6,0	17,0
13	11,0	43,7	7,2	8,1
14	4,0	15,4	26,6	7,8
15	21,0	13,5	7,5	4,2
16	9,9	39,5	7,5	4,2
17	15,0	36,9	4,7	0,0
18	31,0	9,3	11,8	1,5
19	7,3	38,6	4,9	0,0
Среднее значение прироста	18,51	7,38	7,61	6,49
Стандартное отклонение	12,99	3,31	4,51	2,52

■ День 2 (%) ■ День 3 (%) I День 4 (%) вДень 5 (%)

Рисунок 1 – Посуточная эффективность накопления микробной массы в среде с труднодоступным источником углерода

Анализируя таблицу 1 и диаграмму (рисунок 1), можно отметить следующие изменения в течение периода наблюдения по дням:

• -    большинство штаммов активно накапливают с первых до третьих суток культивирования (это свидетельствует о начальной фазе активного роста), после 3 суток темпы накопления биомассы снижаются, к 5-м суткам все штаммы сохраняют положительную динамику роста;

• -    у всех штаммов можно отметить медленные темпы начального роста. Классификация штаммов по типу роста показывает, что 2 штамма проявляют высокий прирост на 2-3 сутки (>50% массы), медленный, но устойчивый рост демонстрируют 3 штамма; низкие темпы роста (<10% в среднем) также демонстрируют три штамма.

При анализе метаболических паттернов установлено, что:

фаза адаптации (1-2 сутки) - средний прирост 18.5%;

фаза логарифмического роста (2-3 сутки) - средний прирост 26.8%;

фаза стабилизации (4-5 сутки) - средний прирост 8.2%.

Штамм №12 показал наибольший прирост на второй день (54,2%), а также значительный прирост на пятый день (17%). Штамм №8 продемонстрировал очень большой прирост на третий день (69%).

Среднее значение прироста на второй день составляет примерно

17%, что подтверждает общий тренд на начальную активизацию роста. Средний прирост на третий и последующие дни колеблется, но остается положительным, что указывает на продолжающийся рост большинства штаммов.

Данные таблицы свидетельствуют о том, что исследуемые штаммы микроорганизмов проходят через фазы активного роста в первые – третьи сутки, после чего накопление микробной массы протекает с незначительной скоростью. Некоторые штаммы, такие как №12 и №8, демонстрируют экстремально высокие уровни активности на определенных этапах, тогда как другие, например, №4 и №9, растут медленнее.

Среда Гетчинсона с КМЦ обеспечивает медленный, но стабильный рост: средний прирост бактериальной массы на 2-е сутки ~20%, на 3-и сутки ~25%. Отсутствуют резкие спады биомассы (только 2 случая отрицательного прироста).

Таблица 2 – Оценка эффективности накопления микробной массы в питательной среде с рубцовым фильтратом и лактозой(тепловая карта)

№ штамма	День 2 (%) День 3 (%) День 4 (%)  Д(е%нь)5 Процент прироста микробной массы
1	90,0	1,1	2,0	2,9
2	74,0	8,9	7,0	5,9
3	106,0	14	5,0	-4,7
4	72,0	5,2	0,0	-9,8
5	196,0	-12,5	0,0	-6,4
6	66,0	43	6,0	0,0
7	100,0	-8,9	-1,7	0,0
8	240,0	-5,8	-2,6	1,6
9	74,0	-15,4	-11,8	2,5
10	109,0	2,2	-1,4	0,0
11	120,0	11,1	1,2	2,4
12	119,0	-8,8	8,8	3,6
13	47,0	65,1	4,6	0,5
14	93,0	17	0,0	1,8
15	162,0	29	-4,7	-2,9
16	178,0	-3,8	-2,5	-6,5
17	138,0	-7,1	-5,4	2,3
18	125,0	4,6	-1,6	-3,3
19	129,0	-10,5	-2,7	3,4
Среднее значение прироста	117,78	6,75	0,01	-0,35
Стандартное отклонение	48,74	20,49	4,90	4,14

Рисунок 2 – Посуточная эффективность накопления микробной массы в среде с легкодоступным источником углерода

Из представленных материалов видно, что большинство штаммов демонстрируют быстрое и значительное накопление массы в первые сутки культивирования, что свидетельствует о начальной фазе активного роста (см. таблицу 2 и рисунок 2).

Многие штаммы после вторых-третьих суток начинают показывать снижение активности роста, вплоть до отрицательных значений или стабилизацию показателей.

Штамм №5 показал наибольший прирост массы на второй день (196,3%), но также и значительное снижение на третий день (-12,5%) культивирования. Штамм №8 имел максимальный прирост биомассы на первый день (240%) среди всех штаммов. Штаммы №4, №9, №15 и №16 показали заметное снижение активности ближе к пятому дню.

Среднее значение прироста бактериальной массы по всем штаммам на второй день составляет около 50%, что подтверждает общий тренд на начальную активизацию роста.

Данные таблицы свидетельствуют о том, что исследуемые штаммы микроорганизмов проходят через фазы активного роста в первые – вторые сутки культивирования, после чего их активность начинает снижаться или стабилизироваться. При этом некоторые штаммы, такие как №5 и №8, демонстрируют экстремально высокие уровни активности на ранних этапах, тогда как другие, например, №6 и №7, быстрее приходят к состоянию стабильности.

Большинство штаммов демонстрируют очень активный рост в первые сутки, а затем происходит стабилизация и снижение концентрации. Микроорганизмы быстро достигают пика своей активности за счет доступности углеводов лактозы, быстрая утилизация лактозы приводит к замедлению роста, гибели части клеток, из-за отсутствия источника углерода.

Среда с лактозой вызывает взрывной, но неустойчивый рост с последующей стабилизацией или снижением биомассы. На 2-е сутки: 17 из 19 штаммов показывают прирост массы более 65%, но на 3-5 сутки: только 6 штаммов сохраняют положительную динамику. К 5-м суткам культивирования 7 штаммов демонстрируют отрицательные значения прироста. Лактоза - эффективный стимулятор быстрого роста, но непригодна для длительного культивирования. Пик метаболической активности приходится на 2-е сутки для большинства штаммов.

Тепловая карта наглядно покажет метаболическое истощение после начального взрывного роста на испытуемой среде.

Таблица 3 – Оценка эффективности накопления микробной массы в питательной среде с рубцовым фильтратом, КМЦ и лактозой (тепловая карта)

№ штамма	День 2 (%) День 3 (%) День 4 (%) День 5 (%) Процент прироста микробной массы
1	137,0	22,0	78,0	1,5
2	109,0	49,0	8,0	20,0
3	219,0	19,0	1,0	0,0
4	94,0	12,0	4,0	5,0
5	196,3	0,0	0,5	4,0
6	135,0	19,0	4,0	6,0
7	168,0	0,0	0,0	0,0
8	120,0	18,0	0,0	6,0
9	39,0	13,0	0,9	5,0
10	68,0	1,0	1,8	2,0
11	121,0	6,0	22,5	10,0
12	124,0	1,5	4,0	5,0
13	128,0	27,0	10,0	0,5
14	132,0	10,0	13,0	8,0
15	185,0	25,0	0,0	1,7
16	142,0	18,0	1,0	1,6
17	191,0	3,6	1,0	4,0
18	163,0	13,3	2,0	4,0
19	187,0	12,4	0,0	4,4
Среднее значение прироста	140,21	13,3	7,98	4,66
Стандартное отклонение	45,92	12,21	17,90	4,57

номера штаммов

■ День 2(%) «День 3(%)  ■ День 4(%)  ■ День 5(%)

Рисунок 3 – Посуточная эффективность накопления микробной массы в среде сдвумя типами источников углерода

Анализируя данные таблицы 3 и рисунок 3, можно заметить следующие изменения по дням и темпам роста штаммов: максимальные значения наблюдаются чаще всего на третий или четвертый день. Некоторые штаммы показывают стабильный рост, вплоть до пятого дня, но большинство штаммов замедляют свой рост к концу периода наблюдений.

Штамм №5 демонстрирует самый высокий прирост на второй день (+196,3%), однако затем следует резкое снижение (-12,5%).

Штаммы №6, №7 и №10 показывают стабильность на последних днях наблюдений (процентные изменения близки к нулю), что говорит об установлении равновесия в росте этих микроорганизмов. Несколько штаммов (№4, №9, №15, №16) имеют отрицательный прирост на последние дни, что указывает на спад активности.

Данные указывают на общую тенденцию увеличения активности микроорганизмов в начале периода наблюдений с последующим стабилизацией или снижением интенсивности накопления биомассы.

Таким образом, наиболее перспективными являются среды, содержащие комплекс источников углерода: труднодоступные и легкодоступные. Это позволяет получить быстрый рост микробной массы, а в дальнейшем медленное ее накопление и сохранение.

Комбинированная среда демонстрирует быстрый стартовый рост с последующей стабилизацией, показывая эффективность синергии источника быстрых и медленных углеводов.

Штаммы №2, №12, №15 –демонстрируют максимальную продуктивность и стабильность. Штаммы №1, №11, №13 - перспективны для ферментации сложных субстратов.

Штамм №1 - демонстрирует второй пик активности на 4-е сутки (+78,6%) после замедления, что указывает на адаптацию к КМЦ после утилизации легких субстратов.

Штамм №2 - показывает ускорение на финальной стадии (+20% на 5-е сутки), свидетельствуя о поздней метаболической активации.

Штамм №11 - имее т W-образную динамику: 121% → 6,1% → 22,5% → 10,5%, что говорит о сложной стратегии утилизации субстратов.

Заключение

Питательная среда с труднодоступным источником углерода демонстрирует среднее значение прироста бактериальной массы -на второй день составляет примерно 17%, что подтверждает общий тренд на начальную активизацию роста. Средний прирост на третий и последующие дни колеблется, но остается положительным, что указывает на продолжающийся рост большинства штаммов. Среда Гетчинсона с КМЦ обеспечивает медленный, но стабильный рост: средний прирост бактериальной массы на 2-е сутки ~20%, на 3-и сутки ~25%. Отсутствуют резкие спады биомассы.

На питательной среде с легкодоступным источником углерода микроорганизмы быстро достигают пика своей активности, быстрая утилизация лактозы приводит к замедлению роста, гибели части клеток, из-за отсутствия источника углерода. Среда вызывает взрывной, но неустойчивый рост с последующей стабилизацией или снижением биомассы. На 2-е сутки: 17 из 19 штаммов показывают прирост массы более 65%, но на 3-5 сутки: только 6 штаммов сохраняют положительную динамику. К 5-м суткам культивирования 7 штаммов демонстрируют отрицательные значения прироста. Лактоза - эффективный стимулятор быстрого роста, но непригодна для длительного культивирования. Пик метаболической активности приходится на 2-е сутки для большинства штаммов. Тепловая карта наглядно покажет метаболическое истощение после начального взрывного роста на испытуемой среде.

На комбинированной среде штаммы демонстрируют быстрый стартовыйростспоследующейстабилизацией,показываяэффективность синергии источника быстрых и медленных углеводов.

Таким образом, наиболее перспективными являются среды, содержащие комплекс источников углерода: труднодоступные и легкодоступные. Это позволяет получить быстрый рост микробной массы, а в дальнейшем медленное ее накопление и сохранение.