Влияние катехоламинов на осмотическую хрупкость эритроцитов рыб в условиях индуцированного стресса

Гематологические методы диагностики традиционно являются самыми массовыми видами лабораторных исследований в ветеринарии. Состав крови изменяется при некоторых физиологических состояниях, позволяет получить лабораторную информацию о состоянии организма, применять её в интересах диагностики заболеваний, контроля за лечением больных животных. Почти всякий патологический процесс вызывает в картине периферической крови (гемограмме) изменения – сдвиги показателей [1].

Определение осмотической резистентности эритроцитов (ОРЭ) является одним из наиболее доступных в лабораторной диагностике методом оценки физико-химических свойств мембран эритроцитов. Изменения ОРЭ наблюдаются при ряде заболеваний у млекопитающих, так при гемолитических анемиях значения этого показателя снижаются, при гемоглобинопатиях, механической желтухе – повышаются [2].

На осмотическую устойчивость эритроцитов рыб влияет множество факторов: стадия их зрелости, температура, питание, состав корма, наличие токсинов в воде [3 ‒ 6], в том числе и стрессовое состояние [7, 8].

Первичной реакцией на воздействие стрессора у рыб являются эндокринные изменения, включающие, прежде всего, выработку катехоламинов (адреналин и норадреналин) и глюкокортикоидов [9, 10, 11].

При этом предполагается существование четырех степеней стрес-сорной реакции: полная стрессорная реакция, включающая повышенное образование катехоламинов и кортизола; частичная с повышенным образованием либо катехоламинов, либо кортизола, и реакции нарушения гомеостаза, которые рыба не воспринимает как стресс и не связанные ни с катехоламинами, ни с кортизолом [11]. В результате возникают вторичные метаболические, осмотические и другие изменения [12, 13, 14].

Ввиду большой трудоемкости процесса определения уровня катехоламинов крови у рыб, изучение механизма осмотических изменений при воздействии стресс-факторов и взаимосвязь этих изменений с содержанием адреналина и норадреналина в крови может дать чувствительный и дешевый инструмент для лабораторной диагностики стрессового состояния рыб.

Цель работы состоит в оценке влияния катехоламинового ответа на осмотическую резистентность эритроцитов тиляпий в условиях индуцированного стресса.

Материалы и методы исследования

Работа выполнена на кафедре ВНБ, хирургии и акушерства факультета ветеринарной медицины и биотехнологий Вологодской ГМХА имени Н. В. Верещагина.

Опыты проводили в аквариумных условиях на 18 нильских тиляпиях (Oreochromis niloticus L.), выращенных в условиях «АкваБиоЦентра» Вологодской ГМХА, которых предварительно разделили на три группы по 6 особей (табл. 1).

Таблица 1 ‒ Характеристика групп рыб в эксперименте .

Группа	Воздействие	Модель
Контрольная (n=6)	интактная	контроль
I экспериментальная (n=6)	инъекция раствора дексаметазон-фосфата (4 мг/мл) в дозе 0,2 мл/ особь однократно	острый стресс
II экспериментальная (n=6)	инъекция суспензии бетаметазона (2,63 мг+6,43 мг/мл) в дозе 0,5 мл/ особь однократно	хронический стресс

Животных I экспериментальной группы однократно обрабатывали дексаметазоном (Эллара, Россия), который метаболизируется в течение 4 часов, путем парентеральных инъекций в дозе 0,2 или 0,8 мг активного вещества дексаметазон фосфата на особь.

Рыбы II экспериментальной группы после адаптации подвергались хроническому стрессу (применяли суспензию бетаметазона (2,63 мг бетаметазона натрия фосфата + 6,43 мг бетаметазона дипропиона-та/мл), период выведения которого более 10 дней. Рыбам инъецирова- ли Дипроспан (Schering-Plough Labo N.V., Бельгия) по 0,5 мл на особь, что соответствует 3,5 мг активного вещества.

Данные синтетические гормоны обладают аналогичным кортикостероидам эффектом [12, 15].

Контрольная группа оставалась интактной.

Рыбы содержались в условиях с обеспечением непрерывной циркуляции воды между аквариумами с принудительной аэрацией при температуре 27 - 30°C (рис. 1) . Для кормления использовали гранулированный корм (режим – 1 раз в сутки).

Рисунок 1 — Экспериментальная установка с обеспечением непрерывной циркуляции воды

Забор крови для определения осмотической устойчивости эритроцитов проводили у рыб с разницей в 21 день шприцом из хвостовой вены в стеклянные пробирки, содержащие 3,8% раствор цитрата натрия в соотношении 1:9, для анализа катехоламинов ‒ в пластиковые пробирки с гепарином и пластиковые пробирки с активатором свертывания и разделительным гелем. Перед отбором проб крови рыб анестезировали при помощи добавления в воду гвоздичного масла в дозе 0,033 мл/л [16] с последующей выдержкой в ней 15 минут.

Оценку состояния функциональных сдвигов в состояние мембран эритроцитов проводили, используя модификацию метода определения осмотической резистентности эритроцитов М.А. Горшковой, Д.А Миллер, Е.Н. Егоровой, Т.А. Федотовой [2].

При исследовании ОРЭ в первую пробирку помещали 2,5 мл дистиллированной воды, во вторую - 2,5 мл изотонического (0,9%) рас- твора натрия хлорида, в третью – по 1,25 дистиллированной воды и изотонического раствора натрия хлорида (для получения 0,45 % раствора NaCl).

Затем во все пробирки добавляли по 0,01 мл крови. Перемешивали и центрифугировали в течение 10 минут при 2000 оборотов в минуту. Измеряли оптическую плотность надосадочных жидкостей трех проб на спектрофотометре при длине волны 414 нм в кювете с длиной поглощающего слоя 1 см против дистиллированной воды. ОРЭ оценивали по степени гемолиза эритроцитов в растворах с разной концентрацией натрия хлорида по сравнению со степенью гемолиза в образце с дистиллированной водой, который принимали за 100%. Степень гемолиза рассчитывали дважды в образцах с 0,9 и 0,45% растворами натрия хлорида по формуле:

H = 100 X Еоп. /Ек. , где H – степень гемолиза (%),

100 – степень гемолиза в образце с дистиллированной водой,

Еоп. - оптическая плотность надосадочной жидкости в образце,

Ек. - оптическая плотность надосадочной жидкости в пробирке с дистиллированной водой [2, 17, 18].

Концентрацию катехоламинов в сыворотке крови устанавливали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в лаборатории ООО «Центр лабораторных исследований».

Полученный в ходе исследования цифровой материал обрабатывался с помощью програмного обеспечения Microsoft Excel и STATISTICA 6.0. Результаты представлены в виде средней величины и стандартной ошибки средней. Сравнение данных проводилось с применением U-критерия Манна-Уитни для независимых групп. Для оценки различий в зависимых выборках с нормальным распределением использовали t-критерий Стьюдента для зависимых выборок.

Результаты исследования

Стресс приводит к массивному высвобождению катехоламинов из хромаффинных клеток, за которым следуют быстрое изменение некоторых функций основных физиологических систем: дыхательной и сердечно-сосудистой [19]. Необходимое количество катехоламинов для проявления этих воздействий редко известно, поскольку химическое определение количеств адреналина и норадреналина затруднительно и требует больших объемов плазмы крови из-за их низкой концентрации [20] .

Количественное содержание адреналина и норадреналина в крови рыб представлено в таблице 2 .

Таблица 2 ‒ Катехоламины тиляпий в ходе эксперимента.

До обработки				21-й день
Наименование показателя	га с о. |_ га ® X II л с *--о о. i-X о 2	К га га А 1-1	га га X с а *—- m i-i	с га 2	га га m i-i	к га га Е II X с а - V m i-i
Адреналин,	11315,5±	3149,33±	7117,0±	83,50±	65,25±	92,50±
пг/мл	11097,5	3066,87	6041,44	23,50	4,23*	14,50
Норадреналин,	1628,5±	728,0±	2219,0±	132,50±	140,25±	172,50±
пг/мл	1486,5	603,03	1723,65	17,50	15,91	57,50
* Различия с показателем второй экспериментальной группы достоверны (p ≤ 0,05).

Содержание адреналина и норадреналина между рыбами одной группы очень сильно варьировалось (для адреналина 65 ‒ 22500 пг/ мл, для норадреналина 115 ‒ 5500 пг/мл), однако их уровни претерпели резкое снижение: адреналина ‒ на 97,9 ‒ 99%, норадреналина ‒ на 80 ‒ 92,2% у всех групп рыб к 21 дню эксперимента. Возможно, в результате анестезии и кратковременного хэндлинг-стресса (венепункция) произошел всплеск катехоламинов у исследованных нами тиляпий, о чем говорит динамика к последнему дню эксперимента не только экспериментальных, но и контрольных значений. В связи с этим можно также предположить, что к концу эксперимента организм исследуемых животных адаптировался к кратковременным стрессовым условиям, или по каким-либо другим причинам, на что указывает падение уровня основных катехоламинов (адреналина и норадреналина) относительно первоначального у всех групп рыб [20].

У всех позвоночных имеет место разнокачественность эритроцитов по резистентным характеристикам (осмотической и кислотной), которая формируется в результате действия на организм внешних и внутренних факторов. У человека в норме гемолиз эритроцитов на- чинает происходить в 0,46–0,42%-ном растворе NaCl, полный гемолиз ‒ в 0,32–0,3%-ном NaCl. Снижение осмотической резистентности эритроцитов происходит вследствие изменений структурных и функциональных свойств мембран эритроцитов, возникающих при старении организма, заболеваниях, обусловленных накоплением скрытых структурных повреждений в белково-липидном каркасе мембран низко- и высокостойких эритроцитов [21, 22].

Степень гемолиза эритроцитов человека, полученная с использованием унифицированного метода М.А. Горшковой, составила в норме 1,61±0,23% в 0,9% растворе натрия хлорида и 25,16±1,83% в 0,45% растворе натрия хлорида [2].

Степень гемолиза эритроцитов рыб, полученная с помощью этого же метода, оказалась значительно ниже, чем эритроцитов человека (табл. 3) , хотя, по данным некоторых авторов, эритроциты рыб по осмотической резистентности уступают таковым у млекопитающих: признаки гемолиза у них могут появляться уже при небольших разведениях физиологического раствора (0,9–0,81%-ный NaCl), массовый гемолиз эритроцитов половозрелых рыб происходит, как правило, при 0,63–0,54%-ном NaCl [23].

Таблица 3 ‒ Степень гемолиза эритроцитов рыб в изотоническом и гипотоническом растворах до стресса, %.

Концентрация раствора		Контрольная группа (n=6)	I эксперимен тальная (n=6)	II эксперимен тальная (n=6)
0,9%-ный натрия	хлорид	0,22±0,06	0,19±0,06	0,13±0,02
0,45%-ный натрия	хлорид	0,30±0,01	0,40±0,04	0,32±0,06

В 0,45%-ном (гипотоническом) растворе хлорида натрия гемолиз происходил значительно интенсивнее, чем в 0,9-ном (изотоническом). Различия в осмотической устойчивости эритроцитов рыб в группах-аналогах не были достоверными.

Острый стресс у рыб обеспечивает адаптацию организма к стрессовым условиям, что сопровождается активацией многих систем организма. Это требует активной работы всех клеток организма и их мембран соответственно [24]. Хронический стресс в свою очередь отрицательно влияет на здоровье организма и снижает устойчивость клеток эритроцитарного ряда к гемолизу [25], но полученные нами результаты оценки ОРЭ рыб спустя 21 день после воздействия гормонов, инду- цирующих острый и хронический стресс, отличаются от данных, полученных у человека (табл. 4).

Таблица 4 ‒ Степень гемолиза эритроцитов рыб в изотоническом и гипотоническом растворах после индуцированного стресса, %.

Концентрация раствора	Контрольная группа (n=6)	I эксперимен тальная (n=6)	II эксперимен тальная (n=6)
0,9%-ный хлорид натрия	0,06±0,01	0,04±0,01	0,02±0,001
0,45%-ный хлорид натрия	0,88±0,38*	0,78±0,39*	0,44±0,04
* Различия с показателем второй экспериментальной группы достоверны (p≤0,05).

Анализируя данные исследования, можно отметить значительное превышение степени гемолиза эритроцитов в 0,45%-ном растворе хлорида натрия у рыб контрольной и I экспериментальной групп над эритроцитами рыб II экспериментальной группы, что можно связать с продолжающимся воздействием хронического стресса у рыб этой группы. В изотоническом растворе натрия хлорида достоверных различий в ОРЭ эритроцитов выявлено не было.

Изучая динамику показателей осмотической устойчивости эритроцитов рыб в гипотоническом растворе, мы получили результаты, представленные на рисунке 2 .

Гемолиз эритроцитов рыб в 0,45% растворе натрия хлорида, %

Рисунок 2 — Динамика степени гемолиза эритроцитов рыб в гипотоническом растворе хлорида натрия до и после гормониндуцированного стресса.

Во всех группах исследуемых рыб эритроциты снизили устойчивость к гемолизу, но наиболее выражен гемолиз в крови рыб контрольной группы. Осмотическая устойчивость эритроцитов рыб, находящихся под воздействием хронического стресса, оказалась в два раза выше таковой рыб контрольной группы. Таким образом, можно заключить, что кортизол влияет на эритроциты рыб, повышая их устойчивость к гемолизу, что возможно связано с нарушением функции их мембран и требует дальнейшего изучения с помощью атомно силовой микроскопии.

Оценивая влияние катехоламинов на осмотическую устойчивость эритроцитов рыб по шкале Чеддока, можно отметить заметную связь между содержанием адреналина и степенью гемолиза эритроцитов, причем до воздействия гормониндуцированного стресса эта связь была отрицательная, а после воздействия - положительная (рис. 3).

Корреляционная зависимость ОРЭ тиляпий от содержания катехоламинов

■ после индуцированного стресса ■ до воздействия стресса

Рисунок 3 — Динамика степени гемолиза эритроцитов рыб в гипотоническом растворе хлорида натрия до и после гормониндуцированного стресса

Заключение

Катехоламиновый ответ тиляпий на модуляцию стресса был неоднозначным, а вариативность показателей у разных рыб была слишком высокая за счет чувствительности этих гормонов, в связи с чем установление интенсивности стресса по данным показателям в рыбоводстве сомнительно и экономически не целесообразно. Поскольку изменения в ОРЭ при воздействии кортизола достаточно заметны и достоверны, а также тесно связаны с уровнем адреналина в крови тиляпий, этот показатель возможно использовать для диагностики стрессового состояния рыб, как дешевый и наиболее доступный в лабораторной диагностике болезней рыб.