Влияние культуральных фильтратов изолятов грибов родов Alternaria, Bipolaris, Ulocladium на прорастание семян и развитие проростков подсолнечника

Введение. Альтернариоз подсолнечника – довольно частое явление. Возбудители – грибы рода Alternaria – поражают в основном листья, стебель, корзинку и семена, вследствие чего снижаются урожай и качество семян. Сведения о высокой вредоносности грибов рода Alternaria встречаются в отечественных и зарубежных публикациях. Например, листовая пятнистость подсолнечника в Греции, вызываемая A. alternata, снижала количество семян и их массу на 16–65 и 15–79 % соответственно [1]. В Аргентине потери урожая семян от альтернариоза достигали 60–90 % [2]. В России заражённость семян подсолнечника грибами рода Alter-naria в зависимости от погодных условий может достигать 100 % и приводить к загниванию центрального корня и недоразвитию корневой системы в целом, следствием чего при неблагоприятных условиях может быть даже гибель растений [3–5].

Таксономическая ревизия грибов этого рода показала, что подсолнечник поражают 4 специализированных патогенных вида Alternaria (из которых в России выявлено 2) и две группы полусапротроф-ных видов . Часто встречаются на семенах и листьях мелкоспоровые токсигенные виды, среди которых преобладает A. tenuissima . По несколько изолятов A. arbores-cens и A. alternata было выявлено в образцах семян из европейской части РФ. A. alternata был также обнаружен на подсолнечнике в ряде стран Европы, Азии и Южной Америки в качестве возбудителя болезни [6].

Молекулярные исследования тёмно-окрашенных гифомицетов, к которым относятся роды Alternaria , Bipolaris, Ulocladium , показали некоторое несоответствие систематики данной группы грибов с точки зрения филогении. На филогенетическом древе виды Alternaria чередуются с видами Bipolaris, Ulocladium и других родов. Поэтому целесообразнее грибы близкие по показателям родства, считать альтер-нариоидными гифомицетами [6].

По данным исследований, проведённых в лаборатории иммунитета и электрофореза ВНИИМК, на юге России на подсолнечнике встречаются различающиеся по экологическим особенностям виды рода Alternaria . Из них специализированные крупноспоровые – A. helianthi, A. helianthiinficiens и A. protenta; мелкоспоровые неспециализированные – A. tenuissima , A. alt e rnata, A. arborescens и комплекс A. infectoria; родственные им –

Stemphylium sp. и Ulocladium sp. Кроме того, из семян подсолнечника впервые в России был выделен еще один темно-окрашенный гифомицет – Bipolaris austra-liensis [7].

Фитотоксичные метаболиты патогенных грибов – один из объектов изучения многими исследователями. Определение степени токсичности культуральной жидкости гриба является одним из биологических методов изучения его патогенных свойств. Метаболиты используют в качестве селектирующих агентов для клеточной селекции устойчивых растений сельскохозяйственных культур к возбудителям грибных болезней [8]. Токсичность культурального фильтрата патогенных грибов для прорастающих семян подсолнечника может быть критерием оценки степени их агрессивности [9].

Виды Alternaria различаются по способности продуцировать токсины. Анализ фитотоксичности культуральной жидкости видов Alternaria при инокуляции листьев 10-дневных растений пшеницы и ячменя в контролируемых условиях показал, что среди мелкоспоровых видов Alternaria наиболее токсигенными являлись виды A. tenuissima и A. alternata . Около половины изолятов комплекса видов А. infectoria обладали умеренной ток-сигенностью, 6 % изолятов были высоко токсигенны, остальные – нетоксигенны. Выявлены высоко токсигенные изоляты среди видов S. vesicarium и U. atrum . Все исследованные изоляты нескольких видов, в том числе А. alternata, A. tenuissima и комплекса A. infectoria , оказались не патогенными для злаков [10].

Цель наших исследований – сравнить токсичность культуральных фильтратов у изолятов разных видов рода Alternaria , а также близкородственных ему Bipolaris и Ulocladium, выделенных из листьев, стебля и семян подсолнечника для определения их патогенных свойств.

Материалы и методы . Использовали общепринятые методики экспериментальной микологии. Моноконидиальные изоляты культивировали в пластиковых чашках Петри на картофельно-морковном агаре (КМА) при 25 °С под лампами дневного света (12-часовой фотопериод). Идентификацию видов тёмноокрашенных гифомицетов, включая Alternaria , вели по определителю E.G. Simmons (2007) [11] и с помощью ключа, составленного Ф.Б. Ганнибалом (2011) [6], начиная с 3-х суток по 10-е (и позже), с помощью микроскопа анализировали габитус спороноше-ния (наличие или отсутствие цепочек спор, их длину и тип ветвления), размер и форму конидий. Для получения культурального фильтрата блок с культурой изолята помещали на жидкую среду Чапека и выращивали 14 дней при постоянной температуре 25 ^оС. После чего фильтровали, освобождая от мицелия и конидий, и разливали по 20 мл в чашки Петри. Семена двух гибридов подсолнечника Кубанский 930 и Меркурий, предварительно промытые в течение часа под проточной водой, закладывали в культуральный фильтрат на 24 ч. Опыт проводили в трёх повторностях, по 100 семянок в каждой. После воздействия культурального фильтрата семянки раскладывали на влажную фильтровальную бумагу по ГОСТ Р 523252005, свёртывали её в рулоны и выращивали 5 дней при температуре 25 ^оС. В качестве контроля использовали среду Чапека и воду. Учитывали количество сгнивших и проросших семян, измеряли длину проростка и центрального корня. Данные обрабатывали методом дисперсионного анализа.

В таблице 1 перечислены изоляты грибов альтернариоидных гифомицетов, их родовая и видовая принадлежность, место сбора, генотип и орган хозяина, из которого они были выделены.

Таблица 1

Происхождение и видовая принадлежность изолятов родов Alternaria, Bipolaris, Ulo-cladium

Изо-лят	Род, вид	Происхождение
		район сбора	год сбора	генотип хозяина	орган хозяина
1	A. helianthiin-ficiens E.G. Simmons, Walcz et R.G. Roberts	Краснодар, поля ВНИИМК	2011	Неизвестен	Лист
2	Alternariaster helianthi (Hansford) Tubaki et Nishihara			Неизвестен	Стебель
3		Крыловский	2012	СПК	Семена
4	Bipolaris aus-traliensis (M.B. Ellis) Tsuda & Ueyama	ОСХ «Березан-ское»	2010	ЦМС Куб 93
5	Bipolaris sp.	Краснодар, поля ВНИИМК	2011	Неизвестен	Лист
6	Ulocladium sp.	теплица ВНИИМК	2012	Неизвестен	Стебель
7	A. tenuissima	Краснодар, поля ВНИИМК	2011	Неизвестен	Лист
8	A. tenuissima	Ставропольский край	2012	Флагман	Семена
9	A. tenuissima
10	A. tenuissima	ФГУП «Березан-ское»		ВК-653
11	′ A. alternata ′ 1
12	′ A. infectoria ′			ВД-541

¹ – ′ A. alternata ′ и ′ A. infectoria ′ означают здесь и далее комплексы видов, включающие различные вариации

Результаты и обсуждение . Из литературных источников известно, что некоторые виды Alternaria (в частности, A. alternata, A. arborescens и A. tenuissima ) являются продуцентами нескольких мико- и фитотоксинов в различных комбинациях. По мнению Андерсена (2001, 2002), состав их практически одинаков и зависит в большей степени от штамма, чем от вида гриба [12; 13]. Наиболее распространенные токсины у перечисленных видов относятся к трем химическим группам: дибензо-а-пироны, включающие альтернариол, монометиловый эфир аль-тернариола, альтенуен, тентоксин; тетрамины – тенуазоновая кислота; производные перилена – альтертоксины I, II и III [15; 16]. Для большинства видов 'A. infectoria' характерен ряд метаболитов, являющихся структурными аналогами токсинов, продуцируемых видами родов

Stemphylium и Ulocladium [16]. Пока неизвестна роль биологической активности этих веществ в патогенезе.

Поскольку методы выделения и очистки токсинов, продуцируемых изолятами рода Alternaria и близкородственных ему Bipolaris, Ulocladium , очень сложны и трудоёмки, мы использовали культуральный фильтрат, состав которого включает все фитотоксические метаболиты.

Для сравнения токсигенности изолятов разных видов Alternaria, Bipolaris и Ulo-cladium , выделенных из листьев, стебля и семян подсолнечника, исследовали влияние культуральных фильтратов на прорастание семян двух гибридов подсолнечника.

Полного ингибирования прорастания семян гибридов подсолнечника после воздействия культуральных фильтратов изученных изолятов не наблюдалось. Количество непроросших семян обоих гибридов во всех вариантах было незначительным и не различалось с контролем – водой. Эти данные мы не приводим, поскольку допускаем, что такой результат может быть следствием влияния других патогенов. Метаболиты всех изолятов, кроме № 6, представленного Ulocladium sp., подавляли развитие корней в большей степени, чем гипокотилей. На рисунках 2, 3 показаны проростки, у которых наблюдалось либо полное отсутствие корней, либо отсутствие только центрального корня. Эти данные согласуются с результатами Федорович с соавторами [17].

а

б

Рисунок 2 – Ненормально развитые проростки подсолнечника после воздействия культурального фильтрата изолята № 4 – Bipolaris australiensis (а) и изолята № 7 – A. tenuissima (б)

Рисунок 1 – Нормально развитые проростки (контроль – вода)

Рисунок 3 – Полное отсутствие корней у проростков подсолнечника после воздействия культуральных фильтратов: а – № 8 – A. tenuissima, б – № 5 – Bipolaris sp., в – № 12 – ′ A. infectoria ′

В таблице 2 представлены средние из трёх повторностей данные по количеству ненормально развитых проростков после воздействия на семена культурального фильтрата изолятов грибов альтернарио-идных гифомицетов .

Таблица 2

Влияние воздействия культуральных фильтратов изолятов родов Alternaria, Bipolaris, Ulocladium на прорастание гибридов подсолнечника

№ изо-лята	Род, вид	Количество проростков с ненормальным* развитием, шт.
		Кубанский 930	Меркурий
1	A. helianthiinficiens E.G. Simmons, Walcz et R.G. Roberts	20	14
2	Alternariaster helianthi (Hansford) Tubaki et Nishihara	38	22
3	Alternariaster helianthi (Hansford) Tubaki et Nishihara	26	30
4	Bipolaris austra-liensis (M.B. Ellis) Tsuda & Ueyama	96	100
5	Bipolaris sp.	46	52
6	Ulocladium sp.	4	10
7	A. tenuissima	96	98
8	A. tenuissima	36	48
9	A. tenuissima	20	16
10	A. tenuissima	30	34
11	′ A. alternata ′	22	18
12	′ A. infectoria ′	58	72
Контроль – среда Чапека		2	3
Контроль – вода		0	0
НСР 05		13,4	12,8

Примечание: *к ненормально развитым отнесли проростки, у которых сгнил или отсутствовал центральный корень (рис. 2, 3)

Данные демонстрируют как межвидовые, так и внутривидовые различия по токсигенности изолятов. Наиболее токси-генными для проростков подсолнечника обоих гибридов были изоляты № 4 – B. aust-raliensis и № 7 – A. tenuissima. Количество проростков с ненормально развитым корнем варьировало от 46 до 100 % у изоля-тов B. australiensis и от 16 до 98 % – у A. tenuissima, что существенно превышало контрольные варианты. Различия между гибридами были в пределах ошибки опыта.

Культуральные фильтраты представителей разных видов: изолят 4 – B. aust- raliensis, 7 – A. tenuissima, 12 – комплекс видов ′A. infectoria′, были токсичными для прорастания семян подсолнечника. Различия по токсичности культуральных фильтратов наблюдались между четырьмя изолятами внутри вида A. tenuissima. Токсигенность изолята, также как и вида, не зависела от органа подсолнечника, из которого он был выделен. Так, изолят № 7, отличившийся высокой токсичностью культурального фильтрата, был выделен из поражённого участка листа, тогда как остальные изоляты вида A. tenuissima – из семян. Метаболиты изолята № 6, принадлежащего Ulocladium sp., не оказали существенного влияния на развитие корней, количество ненормально развитых проростков было на уровне контроля.

Таблица 3

Влияние воздействия культуральных фильтратов изолятов родов Alternaria, Bipolaris, Ulocladium на длину корня и гипокотиля гибридов подсолнечника

№ изо ля-та	Род, вид	Кубанский 930		Меркурий
		Длина, см
		корня	гипо-по-коти-ля	корня	гипо-по-коти-ля
1	A. helianthiinficiens E.G. Simmons, Walcz et R.G. Roberts	8,2	4,9	9,1	2,9
2	Alternariaster helianthi (Hansford) Tubaki et Nishihara	8,8	5,4	6,2	5,7
3	Alternariaster helianthi (Hansford) Tubaki et Nishihara	9,0	5,6	7,8	5,0
4	Bipolaris austra-liensis (M.B. Ellis) Tsuda & Ueyama	-	3,5	-	3,8
5	Bipolaris sp.	4,1	4,6	3,3	4,8
6	Ulocladium sp.	9,2	4,6	8,7	3,5
7	A. tenuissima	-	4,6	-	4,5
8	A. tenuissima	6,2	2,8	3,1	2,8
9	A. tenuissima	7,7	3,0	7,4	3,2
10	A. tenuissima	9,8	4,2	9,2	3,9
11	′ A. alternata ′	10,0	4,1	10,3	3,4
12	′ A. infectoria ′	3,7	2,0	4,0	2,3
Контроль – среда Чапека		10,2	4,4	4,6	4,0
Контроль – вода		9,6	4,2	10,1	3,7
НСР 05		2,3	0,9	2,3	0,3

В таблице 3 приведены усреднённые данные по размерам корня и гипокотиля после воздействия культуральными фильтратами исследуемых изолятов на прорастающие семена. Угнетающее действие оказали изоляты № 4, 7, 5 и 12. Длина корня и гипокотиля в этих вариантах была существенно меньше контрольных (на 5 %-ном уровне значимости).

Культуральные фильтраты других изо-лятов грибов не повлияли на рост и развитие проростков обоих гибридов (табл. 3).

Таким образом, нашими исследованиями установлены как межвидовые различия по токсигенности изученных изолятов альтернарии, так и внутри вида. Культуральные фильтраты некоторых видов родов Alternaria , Bipolaris, Ulocladium в разной степени угнетали рост и развитие корней и гипокотиля у проростков гибридов подсолнечника. Особенно чувствительными к метаболитам были корни. Отмечены различия по степени токсичности культуральных фильтратов у изолятов внутри вида A. tenuissima . Выделены изо-ляты с высокой фитоксичностью у видов Bipolaris australiensis , Bipolaris sp., A. tenuissima. Высокую токсичность проявил также изолят – представитель комплекса видов A. infectoria . Токсигенность изоля-тов грибов Alternaria , Bipolaris, Ulocla-dium не зависела от органов растения подсолнечника, из которых они были выделены.

Исследования выполнены при финансовой поддержке РФФИ и администрации Краснодарского края, грант № 13-04-96586.