Грибы рода Alternaria nees в семенах подсолнечника

Подсолнечник – одна из основных масличных культур. Однако на количество и качество урожая способны существенно влиять поражающие семена патогены, среди которых грибы рода Al-ternaria Nees – одни из наиболее распространенных [1–4]. Инфицированность партий семян ими может превышать 90 % [4]. При этом значительно снижаются как посевные качества семян (энергия прорастания, всхожесть, жизнеспособность и продуктивность), так и пищевые: семена загрязняются опасными для человека и животных микотоксинами, изменяется жирно-кислотный состав, уменьшается масличность, повышается кислотное число масла [1; 5–8].

Род Alternaria включает большое количество видов, различающихся по экологическим свойствам. Часть видов – сапротрофы, а большинство – паразиты с различными специализацией и степенью паразитизма. Эти свойства связаны со способностью грибов рода синтезировать мико- и фитотоксины, которых более 70 [5; 6]. Некоторые из этих токсинов относят к опасным для человека и животных (например, продуцируемые A. alternata альтернариол, альтертоксин, альтернари- ол монометил). Их часто обнаруживают в продукции сельскохозяйственных культур, а также в получаемых из них продуктах питания: зерне злаковых – муке и крупах из него; овощах, фруктах, соках, пасте и др. [6]. По данным EFSA (European Food Safety Authority) за 2011 г., по концентрации токсинов Alternaria sp. в продовольственной группе «Бобовые, орехи и масличные» лидируют семена и масло подсолнечника [6].

Несмотря на большое количество разносторонних исследований альтернариоза подсолнечника, видовой состав возбудителей болезни изучен мало. Во многих опубликованных работах приведены нелегитимные на сегодняшний день наименования видов, если о них вообще упоминается. В 2007 г. был издан определитель E.G. Simmons по Alternaria [9], однако названия видов по устаревшим определителям нередко продолжают использоваться до сих пор. В соответствии с этим определителем, помимо космополитных полусапротрофных, с подсолнечником ассоциировано не менее 11 видов рода [5].

Первая работа, направленная на выявление видов Alternaria на подсолнечнике в регионах Российской Федерации (в том числе и в Краснодарском крае), с использованием современных систематических положений и методов идентификации проведена Ф.Б. Ганнибалом (2011). Из листьев и семян подсолнечника им было выделено несколько видов, впервые в России был обнаружен специализированный к подсолнечнику вид A. helianthi-inficiens E.G. Simmons, Walcz et R.G. Roberts [5].

С 2010 г. мониторинг видов Alternaria на растениях и в семенах подсолнечника в Краснодарском крае и некоторых других регионах России начали проводить во ВНИИМК [10]. Цель исследования – определить видовой состав грибов рода Alternaria Nees в семенах подсолнечника из разных регионов Российской Федерации.

Материал и методы. Проводили фитоэкспертизу образцов семян разных генотипов подсолнечника, собранных в 2010–2013 гг. в ряде районов Краснодарского и Ставропольского краев, Воронежской, Волгоградской, Пензенской, Ростовской и Саратовской областей.

Для выделения микобиоты семена (по 100 штук каждого образца) поверхностно стерилизовали и помещали на питательную среду (голодный агар) в пластиковые чашки Петри диаметром 90 мм (по 10 штук в каждую) и инкубировали при 25 °С до появления конидиального спороноше-ния или мицелия, характерных для Alternaria sp . Пересевали грибы рода Alternaria и подобные им, отмечая состояние пораженной семянки. Получали мо-ноконидиальные изоляты, которые культивировали в пластиковых чашках Петри на картофельно-морковном агаре (КМА) при 25 °С под лампами дневного света (12-часовой фотопериод). Идентификацию видов Alternaria вели по определителю E.G. Simmons (2007) [9] и с помощью ключа, составленного Ф.Б. Ганнибалом (2011) [5], начиная с 3-х суток по 10-е (и позже – до появления спороноше-ния), посредством микроскопа, анализируя габитус спороношения (наличие или отсутствие цепочек спор, их длину и тип ветвления), размер и форму конидий.

По 100 семянок шести образцов разных гибридов подсолнечника готовили аналогично, но перед закладкой на питательную среду посредством стерильных инструментов очищали от плодовой оболочки (лузги), ядра – от семенной оболочки. Части семянок (ядра, плодовые и семенные оболочки) проносили над пламенем горелки, раскладывали в чашки Петри на питательную среду. Инкубировали и идентифицировали проявившиеся грибы как описано выше.

Комплекс видов A. infectoria в тексте статьи обозначали как A. infectoria .

Результаты и обсуждение. За четыре года исследований видового состава возбудителей альтернариоза подсолнечника было проанализировано 107 образцов семян сортов, гибридов и линий, собранных в районах Краснодарского и Ставропольского краев, Воронежской, Волгоградской, Пензенской, Ростовской и Саратовской областей. Образцы были инфицированы этими грибами на 3–58 %, что составило от 8 до 80 % в суммарной зараженности семян микрофлорой (разными грибами и бактериями). Было получено и идентифицировано 1330 моноконидиальных изолятов Alternaria и нескольких других темноокрашенных ги-фомицетов. Результаты анализов нескольких партий семян подсолнечника показаны в таблице 1.

Доминирующее положение занимали неспециализированные мелкоспоровые виды Alternaria. В каждом образце преобладал вид A. tenuissima (Nees et T. Nees:Fr.) Wiltshire. Во многих выборках семян присутствовали A. alternata (Fr.) Keissl и A. infectoria , также встречался A. arbo-rescens E.G. Simmons (единичные случаи) . В нескольких образцах были обнаружены Stemphylium sp. и Ulocladium sp., близкородственные к Alternaria sp. Эти данные сходны с полученными Ф.Б. Ганнибалом (2011) в результате исследования им альтернариозной микофлоры в семенах подсолнечника из нескольких регионов РФ [5].

Крупноспоровые виды встречались редко. Из семян подсолнечника в некоторых странах (например, Индии, Ираке, Пакистане) регулярно выделяют A. helianthi [2; 11; 12]. Однако в наших исследованиях этот вид был выявлен только дважды: по одному изоляту в семенах урожая 2012 г. из Славянского и Белоглинского районов Краснодарского края (табл. 1).

В образце из Калининского района Краснодарского края урожая 2010 г. был обнаружен один изолят, идентифицированный по морфолого-культуральным признакам как A. protenta E.G. Simmons.

Семь изолятов A. helianthiinficiens выделено из семян, собранных в 2013 г. в Саратовской области; в данном регионе этот малоизученный вид, специализированный к подсолнечнику, зарегистрирован впервые. До этого случая в Российской Федерации A. helianthiinficiens был найден в Алтайском (в семенах подсолнечника) и Краснодарском краях (на листьях) [5; 10].

В семенах, собранных в Кореновском районе Краснодарского края в 2010 г., был найден один изолят вида Bipolaris australiensis (M.B. Ellis) Tsuda & Ueyama (телеоморфа Cochiobolus australiensis (Tsuda & Ueyama) Alcorn). На подсолнечнике в Российской Федерации вид был обнаружен впервые [10].

Соотношение видов по результатам идентификации всех 1330 изолятов, выделенных из семян подсолнечника, представлено на рисунке.

Рисунок – Соотношение видов рода Alternaria и других плеоспоровых грибов, выделенных из семян подсолнечника (урожаи 2010–2013 гг.): другие – A. arborescen s, Stemphylium sp., Ulo-cladium sp., B. australiensis и неидентифици-рованные изоляты Alternaria ; специализированные к подсолнечнику – A. protenta, A. helianthiinficiens , A. helianthi

Специализированные к подсолнечнику виды A. helianthi и A. helianthiinficiens составили менее 1 %. Более 95 % принадлежало мелкоспоровым видам Alternaria ,

Таблица 1

Инфицированность образцов семян подсолнечника грибами рода Alternaria и другими темно-окрашенными гифомицетами

ЦЭБ ВНИИМК, 2010–2013 гг.

№	Регион/район сбора	Хозяин1	Год сбора урожая	Изоляты2, шт.
				всего	A. tenuissima	A. alternata	A. infectoria	другие
1	Воронежская область	Гибрид	2010	19	14	1	2	Stemphylium sp. – 1, Alternaria sp.3 – 1
2	Волгоградская область	Гибрид	2011	40	19	5	14	A. arborescens – 2
3		Гибрид1		31	21	3	6	Ulocladium sp. – 1
4		Гибрид		18	7	2	6	Alternaria sp. – 3
5		Гибрид	2012	21	15	5	1	-
6		Сорт		12	8	-	4	-
7		Сорт		29	25	-	2	Stemphylium sp. – 1
8		Гибрид1	2013	20	14	4	2	-
9		Гибрид		15	11	3	-	A. arborescens – 1
10	Ростовская область	Гибрид	2013	24	16	6	-	A. arborescens – 2
11	Пензенская область	Сорт1	2012	14	14	-	-	-
12	Саратовская область	Сорт1	2012	22	14	1	-	A. helianthiinficiens – 7
13		Гибрид	2013	34	20	10	4	-
14	Ставропольски й край	Сорт	2012	14	11	1	2	-
Районы Краснодарского края
15	Кореновский	Гибрид 2	2010	15	10	1	3	B. australiensis – 1
16			2011	26	14	1	10	Alternaria sp. – 1, Stemphylium sp. – 1
17		Гибрид		32	14	8	9	Alternaria sp. – 1
18		Линия1		18	5	6	7	-
19		Линия	2012	6	4	-	2	-
20		Линия		14	9	4	1	-
21	г. Краснодар	Линия1	2011	32	13	4	13	A. arborescens – 2
22				40	22	6	12	-
23		Линия		48	30	3	12	Alternaria sp. – 1, Stemphylium sp. –, Ulocladium sp. – 1
24		Гибрид 2	2013	20	16	3	1	-
25	Калининский		2010	34	24	-	6	A. protenta – 1, A. arborescens – 1
26	Славянский	Линия	2012	16	12	1	2	A. helianthi –1
27	Белоглинский	Сорт		19	11	2	3	A. helianthi – 1, Alternaria sp. –
28	Крыловский	Гибрид		30	23	3	2	Alternaria sp. – 1, Stemphylium sp. – 1

Примечание: 1- образцы обезличены, одинаковые генотипы отмечены цифрами (1, 2); 2- монокони-диальные изоляты; 3- A. alternata-подобные изоляты, которые не смогли по морфологическим признакам идентифицировать до вида причем существенно превалировал A. tenuissima, достигнув 67 %; A. infectoria и A. alternata составили порядка 16 и 13 % соответственно.

За несколько лет исследований были проанализированы образцы семян подсолнечника разных линий, сортов и гибридов, выращенных в нескольких агроклиматических зонах страны. Выборки семян различались по степени инфици-рованности и составу видов Alternaria и других плеоспоровых грибов. Однако по данным, полученным в ходе эксперимента, связь между генотипом подсолнечника и зараженностью семян этими грибами не выявлена. Это отображено и в обобщающей многолетние данные работе А.Д. Бочкового с соавторами (2013): инфициро-ванность семян первого поколения гибридов Меркурий и Гермес в среднем за 2008–2011 гг. была примерно одинаковой (22 и 24 % соответственно), но значительно колебалась по отдельным годам (от 7 до 37 % у Меркурия и от 3 до 44 % у Гермеса). Авторы также анализировали посевные качества этих семян, установив, что инфекционное начало патогенов не оказывало на них существенного влияния: лабораторная всхожесть оставалась на уровне 87–99 % – независимо от степени зараженности образцов [13].

При изоляции грибов мы учитывали состояние пораженной семянки: загнила она либо проросла и проросток развивается. Обе семянки, пораженные A. he-lianthi, и четыре из семи, инфицированных A. helianthiinficiens, не проросли. Почти половина семянок, пораженных A. tenuissima, A. alternata и A. infectoria (каждого вида в отдельности), была невсхожа, или проросток загнивал, покрываясь колонией гриба. Безусловно, в лабораторных опытах негативное воздействие Alternaria sp. на инфицированные семена усиливается, т.к. искусственно обеспечиваются наиболее благоприятные для развития этих грибов условия (освещенность, влажность и температура, отсутствие лимитирующих факторов био- генного характера), и в полевых условиях всхожесть могла быть выше.

Известно, что всхожесть семян подсолнечника при инфицированности этими грибами плодовой оболочки снижается незначительно и существенно – в случае поражения ядер. Это отмечено, например, в публикациях В.Г. Светова (1976), В.М. Лу-комца с соавторами (2011) [1; 14]. D. Singh и S.B. Mathur (2004) констатировали, что мицелий A. alternata (по старой систематике) в семянках без внешних признаков поражения обнаруживался в семенной и плодовой оболочках, а в сильно инфицированных – во всех частях, включая зародыш [15].

Нами был проведен опыт на шести образцах семян, в котором по отдельности анализировали части семянок: зародыша, плодовые и семенные оболочки. Полученные данные представлены в таблице 2.

Таблица 2

Поражение семянок подсолнечника мелкоспоровыми видами Alternaria , %

ЦЭБ ВНИИМК, 2013 г.
Вариант1	Срок хранения семян, месяцев	Части семянки
		плодовая оболочка	семенная оболочка	зародыш
1	4	23	12	6
2	4	27	24	12
3	4	22	19	12
4	4	10	9	6
5	16	63	62	57
6	16	41	41	37

Примечание: ¹ – различные гибриды

Как видно из данных таблицы 2, в каждом из образцов грибами рода Alter-naria были поражены все части семянок. Идентификация показала, что все выделенные грибы рода Alternaria принадлежали к мелкоспоровым видам. В образцах 1–4, хранившихся менее года, наибольшая часть инфекции находилась в плодовой оболочке, а зародыши были заражены в наименьшей степени. Следует отметить, что большая часть семянок с пораженными ядрами в этих вариантах имела механические повреждения. Вероятно, в случае отсутствия последних, определен- ное время плодовая и семенная оболочки способны ограничивать распространение патогена к зародышу. Варианты 5 и 6 были представлены семенами, хранящимися более года. В них все части семянок были поражены в почти одинаковой степени, хотя не более 15 % инфицированных ядер имело признаки механических повреждений (в т. ч. насекомыми). Степень инфи-цированности этих образцов изначально, условия их возделывания, уборки и хранения неизвестны, но возможно, происходило распространение патогена вглубь семянок в период хранения.

Таким образом, в семенах подсолнечника, собранных в семи регионах России, преобладали мелкоспоровые виды Alter-naria с доминированием A. tenuis-sima . Эти грибы присутствовали в разных частях семянок: зародышах, плодовых и семенных оболочках. Специализированные виды A. helianthi, A. helianthiinficiens и A. protenta встречались крайне редко. Также были выделены единичные изоляты Stem-phylium sp., Ulocladium sp. и B. au-stralliensis.