Влияние технологии экстракции на антиоксидантную активность экстрактов плодов черноплодной рябины

Черноплодная рябина (черноплодная арония) принадлежит к семейству розоцветных (Rosaseae), подсемейство яблоневых (Maleae). Это растение привезено в Россию, а затем в другие страны Европы из Северной Америки. Черноплодная рябина по сравнению с другими плодами содержит небольшое количество витамина С, однако богата полифенолами, такими как флавоноиды (флаван-3-олы > антоцианы >> флавонолы) и фенольные кислоты (неохлорогеновая и хлорогеновая кислоты) [1]. Горький вкус плодов обусловлен наличием значительного количества полифенолов, в частности проантоцианидина, а олигомеры полифенолов имеют высокое сродство к белкам, вызывая их расщепление, которое придает ощущение сухости во рту [2].

Из-за специфичного вкуса плоды черноплодной рябины редко употребляются в сыром виде. В основном ее перерабатывают на соки, где терпкий вкус менее заметен. Высокое содержание пектина позволяет перерабатывать черноплодную рябину в джемы, желе и мармелад. При этом из-за высокого содержания антоцианов арония может быть использована для получения натуральных пищевых красителей.

В последнее время наблюдается возрастающий интерес к биоактивным соединениям с полезными для здоровья человека свойствами, к которым относятся полифенольные соединения и флавоноиды. Поэтому поиск наиболее эффективных и экологически чистых методов для экстракции из натуральных продуктов остается актуальной задачей.

Современный темп научно-технического прогресса и генерация новых идей постоянно изменяет их будущее практическое применение. Результаты научных исследований в различных областях знаний, в том числе в пищевой промышленности, получают применение в новых технологиях [8].

Эффективность экстракции биологически активных компонентов из растительных материалов зависит от различных факторов, таких как технология экстракции, природа растворителя, время, температура, модуль, т. е. соотношение растительного материала и растворителя и многие другие [9]. Однако оптимальная технология экстракции имеет решающее значение для обеспечения эффективного извлечения целевых компонентов из растительного материала. Обычные технологии экстракции, такие как экстракция в аппарате Сокслета и мацерация, несмотря на большой расход растворителя, затратность по времени и энергии, до сих пор широко используются. Тем не менее в течение последних десятилетий активно внедряются некоторые новые технологии экстракции, в том числе ультразвуковая и микроволновая, которые являются энергосберегающими и экологически чистыми, с получением высококачественных экстрактов. Теоретически оптимальная технология экстракции должна быть простой, безопасной, воспроизводимой, недорогой и подходить для промышленного применения [10].

Инфракрасное (ИК) облучение становится все более популярным в перерабатывающих отраслях промышленности в качестве эффективного и экологически чистого способа активации процессов. Это обусловлено высокой тепловой эффективностью и быстрой скоростью нагрева по сравнению с конвективным нагревом. Метод также удобен из-за легкого контроля температуры нагрева, простоты применения, значительной экономии пространства и потребления энергии. ИК-аппараты работают по принципу прямого нагрева, где тепло передается непосредственно в центр материала в виде электромагнитных волн без нагрева окружающей среды. Применение энергии инфракрасного излучения для нагрева растворителя при контакте с растительным сырьем в большинстве случаев может улучшить эффективность экстракции по сравнению с обычными методами. Кроме того, по сравнению с другими современными методами экстракции ИК-облучение проще в использовании, дешевле и экологически чище [11].

Таким образом, ИК-излучение может непосредственно нагревать смесь растворителя с растительным сырьем без нагрева окружающего воздуха, в то время как при обычном нагревании необходимо время для нагрева сосуда перед тем как тепло передается к раствору. ИК-излучение используется для повышения эффективности экстракции растворителем биоактивных компонентов растительного сырья [12]. Время экстракции с использованием ИК-облучения при этом значительно снижается по сравнению с обычной экстракцией (с нескольких часов до нескольких минут).

Ультразвуковая инициация экстракции используется для экстракции растительных компонентов [13]. Это приводит к сокращению времени экстракции, расхода растворителя, повышается выход и качество экстрактов. Методика ультразвуковой экстракции особенно привлекательна своей простотой и низкой стоимостью оборудования. Она основана на использовании энергии, получаемой от ультразвука на частотах выше диапазона слышимых для человека (звуковых волн с частотой выше 20 кГц), облегчающей извлечение активных веществ из растительного сырья растворителем [14]. Это приводит к разрушению клеточных стенок растений, и как следствие, увеличивается проницаемость растворителя в растительную клетку. Происходит облегчение перехода активных компонентов в растворитель. Обычно общее время экстракции уменьшается от 3 до 10 раз. В последние годы экстракция с использованием ультразвука для извлечения биологически активных компонентов все больше находит свое применение: экстракции чувствительного ароматического вещества из чеснока [15], выделение масла из оливок [16], экстракции фенольных соединений из клубники [17].

В работе [18] изучалась возможность использования ультразвуковой экстракции в качестве альтернативного метода классической мацерации для извлечения фенольных веществ, танинов и антоцианов из красных ягод винограда. Экстрагирование проводилось водно-спиртовой смесью (50 : 50), содержащей соляную кислоту (pH 2.0), при температуре 0–75 °C в течение 3–15 мин. Авторы статьи отмечают, что при увеличении времени экстрагирования увеличивается количество общих фенольных веществ, а наиболее оптимальной температурой является 10 °C. Установлено, что применение ультразвуковой активации позволяет увеличить выход экстрактивных веществ в получаемом экстракте.

Сербские ученые в своей работе [19] проводили сравнение методов экстракции по выходу экстракта, химическому составу, антиоксидантной активности, общему содержанию фенольных веществ и флавоноидов из плодов лавровишни. Было проведено сравнение классической мацерации и экстракции при ультразвуковом излучении. Ультразвуковая экстракция проводилась при температуре 65 °C в течение 15 мин, в качестве экстрагента использовали метанол. Экстракция методом мацерации проводилась аналогично без применения ультразвуковой ванны. Авторы отмечают, что применение ультразвуковой активации позволяет увеличить выход экстракта, антиоксидантную активность и общее содержание фенольных веществ в получаемых экстрактах.

Корейские ученые проводили исследования по определению химического состава экстрактов из семян винограда [20], полученных под действием инфракрасного излучения. Изучались наиболее оптимальные условия для экстракции при действии инфракрасного излучения. Установлено, что наиболее оптимальной является экстракция 50%-м метанолом в течение 30 мин. Сравнение инфракрасной экстракции с классической экстракцией и экстракцией под действием ультразвукового излучения показывает, что ИК-экстракция является наиболее оптимальным методом для извлечения активных веществ из семян винограда.

Целью данного исследования является сравнение антиоксидантной активности, общего содержания фенольных соединений, флавоноидов и антоцианов экстрактов, получаемых из плодов черноплодной рябины методами мацерации, экстракции при инфракрасном облучении и ультразвуковой экстракции.

Материалы и методы

Экспериментальная работа проводилась на кафедре технологии и организации общественного питания Самарского государственного технического университета.

В качестве объекта исследования выбраны плоды черноплодной рябины (Aronia melanocarpa), произрастающие на территории Самарской области (53 ° 12‘ N и 50 ° 06‘ E) урожая 2016 г. из коллекции НИИ "Жигулевские сады".

Химические вещества и реагенты. Этанол, дистиллированная вода. Реактив Folin – Ciocalteu (Фолин – Чеколтеу), галловая кислота приобретены у фирмы Fluka (Германия). DPPH (2,2-дифенил-1-пикрилгидразил), нитрит натрия, хлорид алюминия, карбонат натрия, линолевая кислота – фирма Sigma-Aldrich Chem. 2,4,6-три(2-пиридил)-s-триазин (TPTZ) – фирма Fluka Chemicals (Spain). Соляная кислота, хлорид калия, уксусная кислота, ацетат натрия, фосфат натрия, хлорид железа (II), хлорид железа (III), роданид аммония.

Общее содержание фенольных соединений. Содержание общих фенолов в водно-этанольных фруктовых экстрактах оценивали с помощью модифицированной версии метода Folin – Ciocalteu [21]. Галловую кислоту использовали в качестве стандарта, водный раствор галловой кислоты (200 мг в 1 л) разбавляли дистиллированной водой, чтобы получить соответствующие концентрации для калибровочной кривой. Для анализа использовали 0,50 мл водно-этанольного плодового экстракта или стандарта галловой кислоты, 4,00 мл дистиллированной воды, 0,25 мл реактива Folin – Ciocalteu и 0,25 мл насыщенного водного раствора карбоната натрия. Образцы встряхивались и выдерживались в темноте в течение 30 мин при комнатной температуре. Коэффициент поглощения измеряли при 725 нм на спектрофотометре. Результаты выражали в мг эквивалента галловой кислоты в 100 г сухого веса.

Общее содержание флавоноидов. Содержание флавоноидов в водно-этанольных экстрактах измеряли с использованием модифицированного метода [22]. Экстракт или стандартный раствор катехина в объеме 0,50 мл добавляли в мерную пробирку объемом 10 мл. Затем добавляли 2,50 мл дистиллированной воды, в нулевой момент времени – 0,15 мл 5%-го нитрита натрия, через 5 мин – 0,30 мл 10%-го хлорида алюминия и выдерживали еще 5 мин. Коэффициент поглощения измеряли при 510 нм. Содержание флавоноидов выражали в мг эквивалента катехина в 100 г сухого веса.

Определение антоцианов. Определение общего содержания антоцианов, присутствующих в анализируемом экстракте, проводили путем измерения коэффициента поглощения при двух различных pH (1,0 и 4,5) при 515 и 700 нм ¹ . Содержание антоцианов выражали в мг эквивалента цианидин-3-гликозида в 100 г сухого вещества.

Антиоксидантная активность в системе линолевой кислоты. Антиоксидантную активность в системе линолевой кислоты определяли следующим образом [23]: к 1,0 мл анализируемого экстракта добавляли 0,5 мл этилового спирта, 0,5 мл дистиллированной воды, 1 мл линолевой кислоты и 2 мл фосфатного буфера (pH 7,0). Смесь выдерживали при 40 °C 120 ч. Затем от полученной смеси брали аликвотную часть (0,1 мл). К аликвоте добавляли 9,7 мл 75 % этилового спирта, 0,1 мл 30%-го раствора роданида аммония, выдерживали 4 мин и добавляли 0,1 мл раствора хлорида железа (II) (0,2 М в 3,5 % HCl). Измеряли оптическую плотность при 500 нм на спектрофотометре. Контрольная проба должна содержать все реагенты за исключением исследуемого экстракта. Антиоксидантная активность выражается в процентах ингибирования окисления линолевой кислоты.

Антиоксидантная активность по методу DPPH. Антиоксидантная активность образцов измерялась в соответствии с методом [24]. Методика основана на способности антиоксидантов исходного сырья связывать стабильный хромоген-радикал 2,2-дифенил-1-пикрилгидрозил (DPPH). DPPH (4 мг) растворяли в 100 мл этанола. Аликвоты исследуемого экстракта (0,05; 0,10; 0,40; 0,80; 1,00 и 5,00 мл) растворяли в 100 мл дистиллированной воды. Затем 2,0 мл каждого раствора добавляли к 2,0 мл раствора DPPH при 20 °C и выдерживали в темноте в течение 30 мин. Определяли коэффициент пропускания при 517 нм. Антирадикальную активность выражали в виде концентрации исходного экстракта в мг/мл, при которой происходило связывание 50 % радикалов.

Метод FRAP. Восстанавливающую силу исследуемого экстракта определяли по методу FRAP [25]. Для анализа использовали свежеприготовленный раствор FRAP: смешивали 10 мл ацетатного буфера (pH 3,6), 1 мл 10 % раствора хлорида железа (III) и 1 мл раствора TPTZ (10 ммоль/л TPTZ в 40 ммоль/л HCl)

и выдерживали 10 мин при температуре 37 °C. К анализируемому экстракту (0,1 мл) добавляли 3,0 мл дистиллированной воды и 1 мл раствора FRAP. Смесь выдерживали в течение 4 мин при температуре 37 °C. Измеряли оптическую плотность при 593 нм. Восстанавливающую силу определяли по калибровочному графику и выражали в ммоль Fe2+ / 1 кг исходного сырья.

Все эксперименты проводились в трехкратном повторении.

Результаты и обсуждение

Условия проведения экстракции были выбраны на основании литературных данных [26]. В качестве растворителя использована смесь этанола и воды в соотношении 1 : 1 [19]. Несмотря на частое использование метанола в промышленных условиях, нами этот растворитель не был рассмотрен из-за его высокой токсичности. Метанол опасен для окружающей среды. Температура оказывает влияние на содержание фенольных веществ, флавоноидов и антоцианов независимо от используемой технологии экстракции. Тем не менее существует оптимальное значение температуры, выше которого извлекаемые фенольные соединения разрушаются. Чтобы оптимизировать технологию экстракции, были выбраны рабочие условия, близкие к оптимальным. В исследовании оптимальной является температура около 35 °C [27]. Для того чтобы избежать термического разложения антиоксидантов, температура установки при экстракции поддерживалась на уровне 35 ± 1 °C.

Получено три образца экстрактов следующими методами:

• 1.    Контроль. Экстракция методом мацерации: измельченные свежие плоды черноплодной смородины (2 г) с 10 мл этанола и 10 мл дистиллированной воды поместили в круглодонную колбу и выдержали при температуре 35 ± 1 °C в течение 2 час. По окончании экстракции жидкая фаза отделена от твердого остатка фильтрацией.

• 2.    ИК. Экстракция при инфракрасном облучении: измельченные свежие плоды черноплодной смородины (2 г) с 10 мл этанола и 10 мл дистиллированной воды поместили в круглодонную колбу и выдержали в течение 2 ч под ИК-лампой мощностью 275 Вт (Anndesum IR lamp) при температуре 35 ± 1 °C. По окончании экстракции жидкая фаза отделена от твердого остатка фильтрацией.

• 3.    УЗ. Экстракция при ультразвуковом излучении: измельченные свежие плоды черноплодной смородины (2 г) с 10 мл этанола и 10 мл дистиллированной воды поместили в круглодонную колбу и выдержали в течение 2 ч в ультразвуковой ванне (ПСБ-2835-05, частота 35 кГц) при температуре 35 ± 1 °C. По окончании экстракции жидкая фаза отделена от твердого остатка фильтрацией.

Общее содержание фенолов, флавоноидов, антоцианов, восстанавливающая сила, антиоксидантная и антирадикальная активность в экстрактах черноплодной рябины, полученных при различных условиях, представлены в таблице.

Таблица. Общее содержание фенолов, флавоноидов, антоцианов, восстанавливающая сила, антиоксидантная и антирадикальная активность экстрактов плодов черноплодной рябины, полученной методом мацерации (контроль), под действием ИК- и УЗ-излучения

Table. The total content of phenols, flavonoids, anthocyanins, restoring force, antioxidant and antiradical activity of chokeberry fruits extracts obtained by maceration (control), under the action of IR radiation and ultrasound

Показатель	Контроль	ИК	УЗ
Общее содержание фенолов, мг галловой кислоты/100 г исходного сырья	1 013 ± 12	1 066 ± 14	1 310 ± 18
Общее содержание флавоноидов, мг катехина/100 г исходного сырья	434 ± 11	452 ± 9	442 ± 7
Общее содержание антоцианов, мг цианидин-3-гликозида/100 г исходного сырья	790,89 ± 7,26	379,07 ± 9,43	859,76 ± 11,74
FRAP значение, ммоль Fe 2+ /1 кг сырья	18,36 ± 2,11	24,48 ± 3,05	19,98 ± 2,78
Антиоксидантная активность в системе линолевой кислоты, % ингибирования окисления линолевой кислоты	27,6 ± 12,69	22,5 ± 15,45	39,9 ± 17,33
Антирадикальная активность, Е с50 , мг/см 3	7,2 ± 0,8	4,2 ± 0,4	6,5 ± 0,5

Для наглядной количественной оценки совокупности полученных данных по каждому параметру применялся критериальный подход. По всем показателям экстракту, полученному методом мацерации, присваивается значение 1, далее производится пересчет каждого показателя и объекта в доле от наивысшего, т. е. от 1. Таким образом, можно наблюдать, во сколько раз увеличиваются или уменьшаются различные показатели в изучаемых экстрактах.

Общее содержание фенольных веществ определяли фотоколориметрическим методом с помощью реактива Folin – Ciocalteu. Методика основана на окислении фенольных групп исследуемого спиртового экстракта реактивом Folin – Ciocalteu в среде насыщенного карбоната натрия. Использование ИКи УЗ-экстракции увеличивает содержание фенольных соединений. Влияние ультразвукового излучения было изучено при 35±5 °C. Метод был сравнен с экстракцией методом мацерации в качестве контроля. Оказалось, что использование ультразвукового излучения увеличивает содержание фенольных соединений в 1,29 раз, что можно связать с распространением волн ультразвукового давления через растворитель и образованием кавитационного пузырька. Кавитационный пузырек может быть образован вблизи поверхности растительного материала. Во время сжатия он создает высокое давление и температуру, которые способны разрушить клеточные стенки матрицы растений и тем самым извлечь содержимое клеток и перевести в растворитель [28]. В случае ИК-экстракции увеличение общего содержания экстракта практически незначительно (в 1,05 раз).

Общее содержание флавоноидов измеряли фотоколориметрическим методом по интенсивности протекания реакции с растворами нитрита натрия и хлорида алюминия. Коэффициент пропускания определяли при длине волны 510 нм. Общее содержание флавоноидов определяли по калибровочной кривой и выражали в мг катехина на 100 г исходного сырья. Использование ИК и УЗИ практически не приводит к изменению содержания флавоноидов в исследуемых экстрактах – в 1,04 и 1,02 соответственно.

Определение общего содержания антоцианов проводится путем измерения оптической плотности при двух разных значениях рН (1,0 и 4,5). Коэффициент пропускания определяли при длине волны 515 и 700 нм. Общее содержание антоцианов определяли по калибровочной кривой и выражали в мг цианидин-3-гликозида на 100 г исходного сырья. Аналогично флавоноидам, общее содержание антоцианов остается практически неизменным при обработке получаемых экстрактов ультразвуковым излучением. В случае же ИК-экстракции наблюдается уменьшение общего содержания антоцианов в экстракте в 2 раза, что может быть связано с деструкцией термонестабильных соединений под действием энергии инфракрасного излучения, используемого для нагрева растворителя.

Антирадикальную активность определяли по методу DPPH. Методика основана на способности антиоксидантов исходного сырья связывать стабильный хромоген-радикал 2,2-дифенил-1-пикрилгидразил (DPPH). Реакция протекала в течение 30 мин в темноте при температуре 20 °С, после чего определяли коэффициент пропускания при 517 нм. Антирадикальную активность выражали в виде концентрации исходного экстракта в мг/мл, при котором происходило связывание 50 % радикалов. Способность тормозить действие свободных радикалов DPPH при экстракции в условиях инфракрасного и ультразвукового излучения для черноплодной рябины увеличивается в 1,1 и 1,7 соответственно.

Восстанавливающую силу изучаемых объектов определяли по методу FRAP. Методика основана на способности активных веществ исходного экстракта восстанавливать трехвалентное железо. Реакция исходного спиртового экстракта с FRAP-реагентом (2,4,6-трипиридил-s-триазином) протекает при 37 °С в течение 4 мин. Коэффициент пропускания измеряется при длине волны 593 нм. Восстанавливающую силу определяли по калибровочному графику и выражали в ммоль Fe ²⁺ / 1 кг исходного сырья. Анализ результатов уровня восстанавливающей силы экстрактов, полученных при действии ИК-излучения, показывает, что изученный показатель растет по сравнению с экстрактами, полученными методом мацерации и при УЗ-облучении.

Антиокислительную активность образцов определяли в системе линолевой кислоты. Методика основана на способности антиоксидантов изучаемого сырья ингибировать процессы окисления линолевой кислоты при условиях, приближенных к состоянию живой клетки. Процесс проводится в модельной системе при температуре 40 °С при рН 7,0 в течение 120 ч, после чего проводится измерение степени окисления по образованию гидроперекисей, реагирующих с растворами NH 4 SCN и FeCl 2 в НСl. Антиоксидантная активность выражается в процентах ингибирования окисления линолевой кислоты. Для экстрактов черноплодной рябины обработка УЗИ позволила увеличить способность ингибирования линолевой кислоты в 1,33.

В наших исследованиях для оценки эффективности экстракции сравнивали мацерацию, экстракцию под действием ИК- и УЗ-излучения. Результаты показали, что экстракция под действием ИК- и УЗ-излучения превосходит классический способ экстракции. Это возможно благодаря механизму действия ИК- и УЗ-излучения на растительную клетку, что отличается от механизма экстракции при мацерации. Длина волны при инфракрасном излучении соответствует характеристикам поглощения растворителем и активных веществ в черноплодной рябине. Под действием ультразвуковых колебаний происходит более быстрое и активное разрушение внутриклеточных тканей растительного сырья, что приводит к интенсификации процесса экстракции и дает возможность увеличить содержание биологически активных соединений в растворе, что также приводит к увеличению целевых соединений в экстракте.

Антирадикальная активность по методу DPPH при мацерации составляет 7,2 ± 0,8 мг/мл, при УЗ-экстракции – 4,2 ± 0,4 мг/мл, что свидетельствует о ее увеличении.

Заключение

Таким образом, из полученных результатов можно сделать выводы:

• 1)    использование ИК- и УЗ-излучения при экстракции позволяет увеличить содержание фенольных веществ по сравнению с классической экстракцией; применение ИК- и УЗ-излучения практически не приводит к изменению содержания флавоноидов, однако ИК-излучение приводит к деструкции антоцианов в водноспиртовых растворах;

• 2)    антирадикальная активность по методу DPPH наиболее высокая при экстракции с инициацией ультразвуковым излучением (увеличение в 1,7 раз); восстанавливающая сила по методу FRAP при ИКи УЗ-излучении увеличивается; антиоксидантная активность в системе линолевой кислоты увеличивается при использовании ИК-излучения.

В целом использование методов УЗ- и ИК-экстракции позволяет увеличить антиоксидантную активность получаемых водно-спиртовых растворов черноплодной рябины. Однако в некоторых случаях, например при экстракции антоцианов, для ИК-экстракции наблюдается уменьшение показателей по сравнению с классической мацерацией. При использовании ультразвуковой экстракции отмечается исключительно положительная динамика увеличения показателей антиоксидантной активности экстрактов по сравнению с показателями экстрактов, полученных классической мацерацией, что может быть объяснено более мягкими условиями УЗ- и ИК-экстракции для термонестабильных соединений черноплодной рябины.