Возможности улучшения терапевтической активности препаратов бактериофагов

экспериментальная и клиническая урология № 4 2023

В условиях роста антибиотикорезистентности микроорганизмов вообще и возбудителей урологиче ской инфекции в частности,а также с учетом специ фики развития урологической инфекции, связанной с персистенцией микроорганизмов в клетках слизистой оболочки мочевого пузыря при рецидивирующем ци стите; в биопленках внутри инфекционных камней почек, на уретральных катетерах, стентах; бессимптом ной бактериурией, актуален поиск альтернативных ме тодов, направленных на улучшение результатов лечения пациентов с хронической инфекцией мочевы водящих путей [1]. В настоящее время в клинической практике в качестве альтернативы антибиотикотерапии широко используют препараты бактериофагов [2-11].

Терапевтическое действие бактериофагов суще ственно отличается от антибиотиков, что делает их ак тивными в отношении бактерий с множественной лекарственной устойчивостью [12]. Природа представ ляет почти бесконечный ресурс фагов: при необходи мости для большинства видов проблемных бактерий можно выделить новые фаги. Бактерии и их фаги по стоянно эволюционируют совместно, это важно, по скольку появляются новые варианты патогенных бак терий и возникают новые сложные ситуации. В терапии заболеваний человека «коктейли» из нескольких фагов могут снизить число бактерий,у которых развилась устойчивость к определенному фагу [13].

Препараты бактериофагов должны содержать облигатно вирулентные фаги, хорошо охарактеризо ванные и высокоочищенные. На фаговых производ ствах коллекция бактериофагов и маточных микро организмов постоянно обновляется из различных ис точников: сточных вод, болот, рек, различных больниц всей страны.Однако для повышения литической ак тивности препаратов бактериофагов к условиям кон кретного стационара необходим постоянный контроль чувствительности основных возбудителей инфекции к коммерческим препаратам бактериофагов и регулярная работа по обновлению (адаптации) коммерческих пре паратов терапевтических бактериофагов.

Цель работы: улучшить литическую активность коммерческих препаратов бактериофагов, адаптиро вать их к возбудителям конкретного стационара – НИИ урологии и интервенционной радиологии им. Н.А. Ло паткина – филиал ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минзд рава России (далее НИИ урологии).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В НИИ урологии в 2022 году было выполнено 6162 культуральных исследований мочи у амбулаторных (2017) и стационарных (1476) пациентов с различными урологическими заболеваниями.

Микробиологические анализы выполняли на анализаторе Phoenix TM M50 (система для идентификации микроорганизмов и определения чувствительности к антимикробным препаратам) компании Becton Dickinson (Великобритания).

Фенотипы антибиотикорезистентности микроорганизмов в стационаре НИИ урологии и фагоустой-чивость уропатогенов в 2022 г. определили у 3493 микроорганизмов.

Для улучшения литического действия коммерческих препаратов бактериофагов к уропатогенам мы периодически отправляли выделенные штаммы микроорганизмов на фаговое производство Так, еще в 2017 году 100 штаммов E.coli (как основного возбудителя мочевой инфекции), выделенных из мочи урологических пациентов,отосланы на фаговое производство НПО «Микроген» в г. Уфа, где проводилась адаптация (подбор) бактериофагов к кишечной палочке.

На фаговом производстве проводили подбор бактериофагов к штаммам кишечной палочки из НИИ урологии таким образом,чтобы бактерии лизировались маточными фагами по методу Аппельмана в титрах не менее, чем на 1-2 порядка выше показателей специфической активности конечного продукта. При этом стабильность лизиса сохранялась после 48±3 часов инкубирования при температуре 37,0° С. При определении специфической активности готовых препаратов бактериофагов, в качестве контрольных, отбирались штаммы из коллекции производственных

Рис.1. Забор сточных вод из клинического корпуса НИИ урологии.

Fig. 1. Wastewater intake from the clinical building of the Research Institute of Urology штаммов бактерий; они не использовались при про изводстве данной серии препарата.После адаптации получено повышение литической активности бакте риофагов к E.coli на 14% (с 78% до 92%).

В дальнейшем ежегодно (кроме перерыва во время пандемии COVID-19) штаммы основных уропа тогенов,выделенных из мочи больных с урологиче скими заболеваниями, регулярно отсылались на фаговое производство.

Для повышения литической активности препара тов бактериофагов необходимо обновление их бакте риофагами из сточных вод конкретного стационара. Мы дважды в 2022 г. забирали сточные воды из кли нического корпуса НИИ урологии в объеме 10 литров (2 канистры по 5 литров), которые отправляли на фа говое производство в г. Уфа (рис. 1), где из них выде ляли бактериофаги. На фаговом производстве проведена адаптация (обновление) коммерческих пре паратов бактериофагов фагами из сточных вод клини ческого корпуса нашего института.

РЕЗУЛЬТАТЫ

По результатам 6162 культуральных анализов мочи (посевы), полученных от урологических пациен тов НИИ урологии на протяжении 2022 г., всего выде лено 3493 микроорганизма. На рисунке 2 представлены данные посевов мочи от амбулаторных (n=2017) и стационарных пациентов (n=1476) НИИ урологии за 2022 г.

Рис. 2. Микроорганизмы, выделенные из мочи пациентов с урологическими заболеваниями, НИИ урологии, 2022 г.

Fig. 2. Microorganisms isolated from the urine of patients with urological diseases, Research Institute of Urology, 2022

Среди фенотипов антибиотикорезистентности у микроорганизмов в нашем стационаре наиболее часто (11,6%) определяли бета-лактамазы расширенного спектра действия (БЛРС, ESBL), метициллин-рези-стентный золотистый стафилококк (MRSA) в 8,4%, ванкомицин-резистентные энтерококки (VRE) в 0,6%, карбапенем-резистентные энтеробактерии (C RE) в 4,5% случаев. Также в стационаре института опреде лили и устойчивость к препаратам бактериофагов (PhR), которая составила 16,3%.

Резистентность уропатогенов,полученных от ам булаторных пациентов в поликлинике НИИ урологии, составила: MRSA 9,9%, БЛРС – 5,3%, ванкомицин-ре зистентные энтерококки – 0,2%, карбапенем-рези стентные энтеробактерии – 1,7%, резистентность к бактериофагам составила 4,0% (рис. 3).

■ поликлиника ■стационар

Рис. 3. Фенотипы (MRSA, ESBL,VRE, CRE) резистентности к антибиотикам и препаратам бактериофагов (PhR), НИИ урологии, 2022 г

Fig. 3. Phenotypes (MRSA, ESBL, VRE, CRE) of resistance to antibiotics and bacteriophage drugs (PhR), Research Institute of Urology, 2022

Примечание:

• MRSA – метициллин-резистентный золотистый стафилококк

• ESBL – бета-лактамазы расширенного спектра действия

• VRE – ванкомицин резистентные энтерококки

• CRE – карбапенем-резистентные энтеробактерии

• PhR – устойчивость к бактериофагам

Наиболее проблемными микроорганизмами – возбудителями урологической инфекции – в настоя щее время являются E.coli, Klebsiella spp., Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus.

Рис. 4. Фенотипы антибиотикорезистентности и фагоустойчивость уропатогенов в стационаре НИИ урологии в 2022 г.

Fig.4. Phenotypes of antibiotic resistance and phage resistance of uropathogens in the hospital of the Research Institute of Urology in 2022.

Примечание:

• ESBL – бета-лактамазы расширенного спектра действия

• CRE – карбапенем-резистентные энтеробактерии

• PhR – фагоустойчивость

• MSSA – метициллин-чувствительный золотистый стафилококк

■ ESBL BCRE BPhR

Рис. 5. Фенотипы резистентности и фагоустойчивость уропатогенов в поликлинике НИИ урологии в 2022 г.

Fig. 5. Resistance phenotypes and phage resistance of uropathogens in the outpatient clinics of the Research Institute of Urology in 2022 Примечание:

• ESBL – бета-лактамазы расширенного спектра действия

• CRE – карбапенем-резистентные энтеробактерии

• PhR – фагоустойчивость

• MSSA – метициллин-чувствительный золотистый стафилококк

На рисунках 4 и 5 представлены фенотипы резистент ности этих уропатогенов.

Чувствительность и устойчивость уропатогенов к антимикробным препаратам по данным лаборатории микробиологии НИИ урологии в 2022 году представ лены в таблице 1.

В течение 2022-2023 гг. мы также ежемесячно от правляли на фаговое производство отсеянные штаммы выделенных возбудителей урологической инфекции, после чего был получен лиофилизат, на основе кото рого были изготовлены адаптированные препараты бактериофагов.Получено повышение литической ак тивности препарата пиобактериофага поливалентного «Секстафаг», содержащего в 1 мл стерильные очищен ные фильтраты фаголизатов бактерий Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Proteus (P.vulgaris, P.mirabilis) Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumonia, Escherichia coli, к уропатогенным штаммам E.coli на 16% (с 48% до 64%).

ОБСУЖДЕНИЕ

По данным культурального исследования мочи амбулаторных и стационарных пациентов, в НИИ уро логии в 2022 г чаще всего выделяли Enterococcus faecalis (22,6%). Далее следует во внебольничной среде – Staphylococcus haemolyticus (18%), Escherichia coli (13,5%), Staphylococcus epidermidis (6,9%), Staphylococcus aureus (4,2%), Corynebacterium spp. (3,7%), Klebsiella pneumoniae (3,2%), Staphylococcus agalactiae группа В (2,2%) и Klebsiella spр. (1,9%). У стационарных пациен тов выделены следующие микроорганизмы: Escherichia coli (17,6%), Klebsiella pneumoniae (6,3%), Staphylococcus epidermidis (5,4%), Pseudomonas aeruginosa (4,5%),

Таблица 1. Чувствительность и устойчивость уропатогенов к антимикробным препаратам по данным лаборатории микробиологии НИИ урологии в 2022 году

Table 1. Sensitivity and resistance of uropathogens to antimicrobial drugs according to the microbiology laboratory of the Research Institute of Urology in 2022

Микроорганизм Microorganism	E.coli			Klebsiella pneumoniae			Pseudomonas aeruginosa			Staphylococcus aureus			Proteus mirabilis
Антимикробные препараты/ чувствительность (S) и резистентность (R), чувствительность при повышенной дозе антимикробного препарата (I) Antimicrobials/ sensitivity (S) and resistance (R), sensitivity with an increased dose of an antimicrobial drug (I)	S %	R%	I%	S %	R%	I%	S %	R%	I%	S %	R%	I%	S %	R%	I%
Амикацин Amikacin	93,7	3,8	2,5	78,8	17,4	3,8	64,7	34,1	1,2	91,9	8,1	–	69,8	30,2	–
Амоксициллин/ Клавулановая кислота Amoxicillin/ Clavulanic acid	61,8	38,2	–	41,3	58,7	–	–	100	–	84,6	15,4	–	68,5	31,5	–
Ампициллин Ampicillin	32,3	67,6	–	–	100	–	–	100	–	8,6	91,4	–	37,3	62,7	–
Гентамицин Gentamicin	79,5	20,5	–	64,1	35,9	–	68,4	31,6	–	73,9	26,1	–	28,8	71,2	–
Левофлоксацин Levofloxacin	50,2	47,4	2,4	41,7	54,5	3,8	16,1	64,2	19,7	10,5	8,9	80,6	39,0	59,3	1,7
Фосфомицин Fosfomycin	98,1	1,9	–	64,4	35,6	–	*	*	*	93,1	6,9	–	75	25	–
Нитрофурантоин Nitrofurantoin	93,5	6,5	–	66,7	33,3	–	–	100	–	*	*	*	–	100	–
Цефтриаксон Ceftriaxone	55	44,8	0,2	46,8	53,2	–	–	100	–	*	*	*	62,2	32,1	5,7
Цефиксим Cefixime	50	49,5	0,5	41,4	58,6	–	*	*	*	*	*	*	51,5	48,5	–
Цефепим Cefepime	54,5	37,2	8,3	44,4	51,8	3,8	27,4	45,2	27,4	*	*	*	83,3	16,7	–
Ципрофлоксацин Ciprofloxacin	41,3	51,1	7,6	41,3	54,8	3,9	1,6	71,4	27	2,7	9,0	88,3	39,6	60,4	–
Пиперациллин/ Тазобактам Piperacillin/ Tazobactam	54,5	43,6	1,9	54,5	43,6	1,9	1,6	47,6	50,8	*	*	*	92,5	5,7	1,8
Меропенем Meropenem	68,6	25	6,4	68,6	25	6,4	45,2	38,7	16,1	*	*	*	100	–	–
Секстафаг Sextaphage	62,4	37,6	–	23,3	76,7	–	41,7	58,3	–	33,3	66,7	–	14,3	85,7	–

Примечание: * - не определяли чувствительность Note: * - sensitivity was not determined

Staphylococcus haemolyticus (4,4%), Staphylococcus sapro phyticus (3,4%), Klebsiella spр. (2,8%), Staphylococcus aureus (2,7%) и Proteus mirabilis (2,6%).

Такое бактериальное разнообразие, особенно грамположительной флоры (энтерококки, стафило кокки), не должно смущать врачей урологов. Эти мик роорганизмы, как правило, не являются возбудителями инфекций мочевых путей, как внебольничных, так и инфекций, связанных с оказанием медицинской по мощи (ИСМП). Частота появления фекального энтеро кокка в моче может отражать частое использование в клинической практике антибиотиков группы цефалос поринов и хинолонов/фторхинолонов, которые не дей ствуют на энтерококки (природная устой-чивость) [13]. Наличие Staphylococcus epidermidis, Corynebacterium spp. Staphylococcus agalactiae может отражать неправильный сбор мочи для анализа, несоблюдение санитарно-гигие нических требований, в результате которого в мочу по падают микроорганизмы с кожи, слизистых оболочек из влагалища и передней части уретры [1].

Широкое необоснованное назначение врачами антибактериальных препаратов при обнаружении бак

терий в моче при отсутствии клинических признаков инфекционно-воспалительного заболевания (бессимптомная бактериурия), особенно на фоне конкрементов, дренажей, стентов способствует селекции антибиотикорезистентных штаммов микроорганизмов, выработке ими различных механизмов антибиотикоре-зистентности [14, 15]. Анализ данных антибиотико- и фагоустойчивости уропатогенов за 2022 год свидетельствует о мультирезистентных микроорганизмах в нашей клинике.В условиях возникновения тяжелых инфекционно-воспалительных заболеваний, чаще послеоперационных, вызванных антибиотикорезистентными уропатогенами, назначение эффективной антибиотикотерапии становится проблемным. В современных условиях, а также при отсутствии поступления новых зарубежных антибактериальных препаратов в нашу страну, конечно, проводится работа по поиску альтернативных антибиотикам лекарственных препаратов, в частности бактериофагов. Неоспоримым преимуществом фаготерапии перед химическими антимикробными препаратами является использование эволюционного потенциала фагов в качестве противовеса адаптационным возможностям патогенных бактерий (16). Хотя устойчивость бактерий к любому конкретному вирусу возникает гораздо легче, чем к антибиотикам, практически всегда возможно относительно легко подобрать новый фаг, который будет активен против резистентного штамма. Важно, что корреляции между устойчивостью к фагам и антибиотикам не наблюдается, поэтому даже мультирезистентные и панрезистентные штаммы, не являются более сложными в смысле подбора активных против них фагов, чем обычные штаммы возбудителей [16]. Главным преимуществом фаговой терапии является возможность использования природного разнообразия фагов путем быстрого выделения новых фаговых изолятов, активных против актуальных возбудителей, и их оперативного включения в терапевтические коктейли [17-23].

Опасения касательно способности фагов осуществлять трансдукцию генетического материала, а также роли умеренных фагов в патогенности многих возбудителей требуют гарантии исключения присутствия в препаратах умеренных фагов и побдора для использования в терапии фагов, не способных к общей трансдукции генов [16].

Для улучшения качества отечественных препара тов бактериофагов компания НПО «Микроген» посто янно улучшает свои препараты. Они подбирают и создают специальные производственные штаммы,со храняющие чувствительность к бактериофагам, кото рые необходимо ввести в состав препарата, но не несущие активных профагов.Регулярно проводится контроль качества фаговых препаратов, непрерывный мониторинг состава циркулирующих штаммов соот ветствующих возбудителей и оперативная замена фагов в составе препаратов для обеспечения достаточ ного спектра активности.

Целевой спектр активности коммерческих препа ратов бактериофагов должен быть не менее 70%, од нако, как показано в таблице 1, реальная чувствитель ность уропатогенов к препаратам бактериофагов значительно ниже – от 14,3 до 62,4%. В связи с этим возникает потребность регулярного обновления кок тейля фагов с целью адаптации коммерческих препа ратов бактериофагов к условиям бактериологического пейзажа конкретного стационара.

Коллекция штаммов бактерий НПО Микроген в настоящее время составляет более 18 000 штаммов со всей территории РФ, из них более 7 000 поступили в последние 3 года. Адаптация (обновление) препаратов бактериофагов происходит регулярно,после адапта ции процент чувствительности уропатогенов из кли ники НИИ урологии к коммерческим препаратам бактериофагов в августе 2023 г. увеличился в среднем на 20-30%, что нашло отражение в клинической эф фективности бактериофаготерапии.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Для улучшения литической активности препара тов бактериофагов и повышения эффективности лече ния урологической инфекции необходимо постоянно обновлять состав коктейля коммерческих препаратов бактериофагов фагами, к которым чувствительны све жевыделенные штаммы уропатогенов из сточных вод больниц и производственной коллекции фагов, а также отсылать для обновления коммерческих препа ратов на производство отсеянные возбудители от па циентов с урологической инфекцией.

ИШАТШШЕЕЕЕШЕ

(In Russian)].

ИШАША/ШПИШ

Urologija i nefrologija = Urology Nefrology 1995;(5):14-7. (In Russian)].

Сведения об авторах:

Перепанова Т.С. – д.м.н., профессор, руководитель группы инфекционновоспалительных заболеваний и клинической фармакологии отдела общей и реконструктивной урологии НИИ урологии и интервенционной радиологии им. Н.А. Лопаткина – филиал ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России; Москва, Россия; РИНЦ Author ID 98934,

Казаченко А.В. – д.м.н., заместитель директора по лечебной работе НИИ урологии и интервенционной радиологии им. Н.А. Лопаткина – Филиал ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России, профессор кафедры урологии и оперативной нефрологии с курсом онкоурологии ФГВО «Российский университет дружбы народов»; Москва, Россия; РИНЦ ID 334714,

Малова Ю.А. – специалист организационно-методического отдела НИИ урологии и интервенционной радиологии им. Н.А. Лопаткина – филиал ФГБУ «МНИЦ радиологии»; Москва, Россия; РИНЦ Author ID 1023068

Information about authors:

Perepanova T.S. – Dr. Sci., professor, Head of the Department of infectious and inflammatory diseases and clinical pharmacology N. Lopatkin Scientific Research Institute of Urology and Interventional Radiology – Branch of the National Medical Research Centre of Radiology of the Ministry of Health of Russian Federation; Moscow, Russia; RSCI Author ID 98934,

Kazachenko A.V. – Dr. Sci., Deputy Director for Medical Work of N. Lopatkin Scientific Research Institute of Urology and Interventional Radiology – Branch of the National Medical Research Centre of Radiology of the Ministry of Health of Russian Federation, professor of the Department of Urology and Operative Nephrology with a course of oncourology of RUDN University; Moscow, Russia; RSCI Author ID 334714,

Malova Yu.A. – specialist of N. Lopatkin Scientific Research Institute of Urology and Interventional Radiology – Branch of the National Medical Research Centre of Radiology; Moscow, Russia; RSCI Author ID 1023068

Хазан П.Л. – к.м.н., с.н.с. группы инфекционно-воспалительных заболеваний и клинической фармакологии отдела общей и реконструктивной урологии НИИ урологии и интервенционной радиологии им. Н.А. Лопаткина – филиал ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России; Москва, Россия; РИНЦ Author ID 699146

Назиров М.Р. – заведующий клинико-диагностической лабораторией НИИ урологии и интервенционной радиологии им. Н.А. Лопаткина – филиал ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России; Москва, Россия;

РИНЦ Author ID 810306

Псеунова Д.Р. – врач-бактериолог клинико-диагностической лаборатории

НИИ урологии и интервенционной радиологии им. Н.А. Лопаткина – филиал ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России; Москва, Россия

Аполихин О.И. – д.м.н., профессор, чл.-корр. РАН, директор НИИ урологии и интервенционной радиологии им. Н.А. Лопаткина – филиал ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России; Москва, Россия; РИНЦ Author ID 683661,

Каприн А.Д. – д.м.н., профессор, академик РАН, генеральный директор ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России, директор МНИОИ имени П.А. Герцена, зав. кафедрой онкологии и рентгенорадиологии им. В.П. Харченко РУДН, главный внештатный онколог Минздрава России; Москва, Россия; РИНЦ Author ID 96775;

Вклад авторов:

Перепанова Т.С. – идея статьи, организационные работы по выполнению работы, анализ полученных данных, написание и редактирование текста статьи, 30% Казаченко А.В. – организация проведения микробиологических анализов, забора сточных вод, участие в написании текста статьи, 10%

Малова Ю.А. – cбор сточных вод, обработка полученных данных и написание текста статьи, 20%

Хазан П.Л. – участие в сборе сточных вод, в обработке результатов микробиологических данных, участие в написании текста статьи, 10%

Назиров М.Р. – организация проведения микробиологических анализов, обработка полученных результатов, участие в написании текста статьи, 10%.

Псеунова Д.Р. – выполнение микробиологических анализов, обработка полученных результатов, участие в написании статьи, 10%

Аполихин О.И. – общее руководство, 5%

Каприн А.Д. – общее руководство, 5%

Конфликт интересов: Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Финансирование: Исследование проведено без финансовой поддержки.