Вторичный скрининг перспективных штаммов-продуцентов микробиопрепаратов против возбудителя фузариоза льна масличного на фоне искусственного заражения в почвосмеси

Введение. В лаборатории биометода ВНИИМК проводятся многолетние исследования по разработке биологических мер борьбы с болезнями масличных культур. В последние годы начаты исследования по разработке микробиологического метода снижения вредоносности наиболее распространенной болезни льна масличного – фузариоза.

В основе разработанной нами концепции целенаправленного создания микробиопрепаратов для защиты сельскохозяйственных культур от болезней лежит ступенчатый скрининг выделенных штаммов антагонистов фитопатогенов к наиболее распространенным и вредоносным возбудителям болезней. На первом этапе вторичного скрининга лабораторные образцы микробиопрепаратов, изготовленные на основе выделенных в первичном скрининге перспективных штаммов, оценивают на фоне искусственного заражения патогенами в лабораторных условиях во влажной камере in vitro по модифицированным нами методам [1; 2; 3; 4].

На втором этапе вторичного скрининга лабораторные образцы микробиопрепаратов, изготовленные на основе выделенных на первом этапе перспективных штаммов, оценивают на фоне искусственного заражения патогенами в лабораторных условиях в грунте.

В результате первичного скрининга к возбудителям фузариоза льна масличного Fusarium oxysporum Schlecht. emend. Shyd. et Hans. var . orthoceras (App. et Wr.) Bilai и Fusarium poae (Peck) Wollenw., Lewis из 60 коллекционных штаммов антагонистов лаборатории биометода выделены 43 перспективных штамма, проявивших антагонистическую активность к обоим патогенам. Из них 15 перспективных штаммов грибов, 20 штаммов бактерий из рода Bacillus и 8 штаммов бактерий из рода Pseudomonas [5; 6].

На первом этапе вторичного скрининга 43 перспективных штаммов антагонистов к возбудителю фузариоза льна масличного Fusarium oxysporum var. orthoceras in vitro выделено 32 перспективных штамма-продуцента микробиопрепаратов, показавших биологическую эффективность, превышающую 50,0 % [7].

Настоящая работа посвящена второму этапу вторичного скрининга выделенных перспективных штаммов антагонистов к наиболее распространенному возбудителю фузариоза льна масличного Fusarium oxysporum var. orthoceras на фоне искусственного заражения патогеном в лабораторных условиях в почвосмеси.

Материалы и методы. На основе выделенных в первом этапе вторичного скрининга перспективных штаммов антагонистов изготавливали лабораторные образцы микробиопрепаратов в препаративной форме «жидкая культура» (ЖК), при глубинном культивировании штаммов на качалке, со скоростью вращения 200 об./мин, в колбах Эрленмейера, объёмом 750 мл, при объемах среды 150 мл. Грибы выращивали в течение 4-х суток на среде Рудакова [8], бактерии – в течение 2-х суток, из рода Bacillus – на среде Тай-лона-3 [2], а из рода Pseudomonas – на среде Кинга В [9]. Титр определяли методом серийных разведений [10].

Семена льна масличного сорта ВНИИМК 620 обрабатывали лабораторными образцами микробиопрепаратов вручную в круглодонных колбах, с нормами расхода препарата 3,0 л/т, рабочей жидкости – 6,0 л/т и хранили в течение 3-х суток.

Патогенный изолят возбудителя фуза-риоза льна масличного Fusarium oxysporum var. orthoceras предварительно выращивали на стерилизованных семенах льна в течение 30 суток при температуре 25 оС. Семена с выросшим патогеном высушивали под вытяжкой и размалывали на мельнице с охлаждением. В растильни размером 25 × 12 × 5 см засыпали 600 г смеси почвы с песком в соотношении 2 : 1, увлажняли (100 мл) и формировали рядки длиной 11 см. В каждый рядок на глубину 2 см засыпали по 5 г порошка патогена, распределяя его равномерно по всей длине, после чего почвосмесь разравнивали, еще незначительно увлажняли (15 мл на рядок) и оставляли при температуре 19– 21 оС. Через двое суток, когда патоген в почве пророс, в рядки высевали по 10 семян льна, обработанных лабораторными образцами микробиопрепаратов. Контроль – семена льна, обработанные стерильной водой, с нормой расхода 6,0 л/т, с внесением патогена. Повторность 3-кратная. Растения льна выращивали в растильнях на стеллажах в культуральной комнате с подсветкой (16 ч день, 8 ч ночь, с интенсивностью освещения не менее 8000 люкс) при температуре 22–24 °С в течение 20 суток. Почвосмесь увлажняли между рядами, не допуская пересыхания и излишнего переувлажнения. Учитывали всхожесть семян. Не проросшие семена выкапывали, промывали в воде и определяли причину невсхожести, помещая их во влажную камеру. Корни взошедших растений также промывали в воде и распределяли по группам, соответствующим баллам поражения возбудителем фуза-риоза:

• 0 баллов – здоровые корни;

• 1    балл – штрихи и пятна на главном и боковых корешках растений;

• 2    балла – отгнивание главного корня растения.

Биологическую эффективность лабораторных образцов микробиопрепаратов определяли по второму баллу поражения корней льна возбудителем фузариоза по формуле [11]:

С = 100 (a – b) / a, где С – биологическая эффективность, %;

a – количество больных растений в контроле;

b – количество больных растений в варианте.

Результаты и обсуждение. В результате оценки лабораторных образцов микробиопрепаратов в препаративной форме ЖК на основе 32 штаммов антагонистов, выделенных в первом этапе вторичного скрининга, установлен 21 перспективный штамм-продуцент, показавший на фоне искусственного заражения льна масличного возбудителем фузариоза Fusarium oxysporum var. orthoceras в лабораторных условиях в почвосмеси высокую всхожесть семян и биологическую эффективность препаратов по поражению корней, превышающую 50,0 %. При этом у девяти штаммов-продуцентов установлена одновременно максимальная всхожесть семян и высокая эффективность лабораторных образцов по поражению корней возбудителем фузариоза.

Из 12 перспективных грибов антагонистов максимальная всхожесть семян льна на жестком фоне заражения возбудителем фузариоза в контроле с внесением инфекции (80,0 %) отмечена у трех штаммов: Т-1 (70,0 %), а у Т-2 Trichoderma sp. и И-3 Basidiomycetes (60,0 %). При этом было установлено, что не взошедшие (сгнившие) семена были поражены возбудителем фузариоза (табл. 1).

Таблица 1

Эффективность обработки семян льна масличного лабораторными образцами микробиопрепаратов на основе перспективных штаммов грибов антагонистов на фоне искусственного заражения возбудителем фузариоза Fusarium oxysporum var. orthoceras в почвосмеси, через 20 суток г. Краснодар, ЦЭБ, ВНИИМК, 2019 г.

№ п/п	Вариант	Титр, КОЕ/мл	Всхожесть, %	Поражено фузариозом корней, %, по баллам			Биологическая эффек-тив-ность, % (по 2-му баллу)
				0	1	2
1	Контроль без инфекции	-	75,0	0	0	0	-
2	Контроль с инфекцией	-	17,5	20,0	0	80,0	-
3	T-1 Trichoderma sp.	2,8 × 109	70,0	71,4	0	28,6	64,3
4	T-2 Trichoderma sp.	3,0 × 109	60,0	50,0	0	50,0	37,5
5	T-3 Trichoderma sp.	3,8 × 109	35,0	42,8	28,6	28,6	64,3
6	T-4 Trichoderma sp.	3,5 × 109	30,0	16,7	33,3	50,0	37,5
7	Tk-1 Trichoderma koningii	2,9 × 109	25,0	60,0	0	40,0	50,0
8	Pv-3 Penicillium verrucosum	8,5 × 109	25,0	20,0	0	80,0	0
9	Pr-1 Penicillium rugulosum	6,8 × 109	40,0	75,0	0	25,0	68,8
10	A-1 Basidiomycetes	2,8 × 107	20,0	50,0	50,0	0	100
11	И-3 Basidiomycetes	2,5 × 107	60,0	91,7	8,3	0	100
12	Xk-1 Chaetomium olivaceum	6,5 × 107	40,0	50,0	25,0	25,0	68,8
13	Xk-3 Chaetomium globosum	8,8 × 107	20,0	75,0	0	25,0	68,8
14	An-1 Aspergillus niger	4,5 × 1010	45,0	33,4	22,2	44,4	44,5

У взошедших растений льна биологическую эффективность применения лабораторных образцов препаратов считали по поражению корней возбудителем фу-зариоза со 2-м баллом (отгнивание главного корня растения), так как отдельные штрихи и пятна на главном и боковых корешках растений при первом балле поражения не оказывали существенного влияния на рост растений. Максимальную эффективность показали восемь штаммов: T-1, Т-3 Trichoderma sp., Tk-1 Trichoderma koningii, Pr-1 Penicillium rugulosum, A-1 Basidiomycetes, И-3 Basidiomycetes, Xk-1 Chaetomium olivaceum и Хk-3 Chaetomium globosum. При этом одновременно максимальная всхожесть семян и высокая эффективность препаратов по поражению корней установлена у двух штаммов – Т-1 Trichoderma sp. (70,0 и 64,3 % соответственно) и И-3 Basidiomycetes (60,0 и 100 % соответственно) (рис. 1).

а

б

в

Рисунок 1 – Всхожесть семян льна масличного, обработанных лабораторными образцами микробиопрепаратов на основе перспективных грибных штаммов на фоне искусственного заражения возбудителем фузариоза Fusarium oxysporum var. orthoceras в почвосмеси, через 20 суток, 2019 г. (ориг.):

а – контроль без обработки;

б – Т-1 Trichoderma sp .; в – И-3 Basidiomycetes

Из 13 перспективных штаммов бактерий из рода Bacillus максимальная всхожесть семян льна на жестком фоне поражения возбудителем фузариоза отмечена у семи штаммов (табл. 2).

Таблица 2

Эффективность обработки семян льна масличного лабораторными образцами микробиопрепаратов на основе перспективных штаммов бактерий антагонистов из рода Bacillus на фоне искусственного заражения возбудителем фузариоза Fusarium oxysporum var. orthoceras в почвосмеси, через 20 суток г. Краснодар, ЦЭБ, ВНИИМК, 2019 г.

№ п/п	Вариант	Титр, КОЕ/мл	Всхо жесть, %	Поражено фузариозом корней, %, по баллам			Биологическая эффективность, % (по 2-му баллу)
				0	1	2
1	Контроль без инфекции	-	75,0	0	0	0	-
2	Контроль с инфекцией	-	17,5	20,0	0	80,0	-
3	3-2 Bacillus sp.	1,8 × 1010	30,0	0	50,0	50,0	37,5
4	D 1-1 Bacillus sp.	1,6 × 1010	80,0	50,0	12,5	37,5	53,1
5	Fa4-1 B. subtilis	2,4 × 1010	65,0	53,8	0	46,2	42,3
6	Fa 4-2 Bacillus sp.	2,1 × 1010	35,0	71,4	0	28,6	64,3
7	K 1-2 Bacillus sp.	2,8 × 1010	60,0	50,0	25,0	25,0	68,8
8	5-3 Bacillus sp.	3,1 × 1010	40,0	0	0	100	0
9	D 7-3 Bacillus sp.	3,4 × 1010	65,0	61,5	0	38,5	51,9
10	11-2 Bacillus sp.	2,0 × 1010	70,0	50,0	0	50,0	37,5
11	Б(2-1) B. licheniformis	3,9 × 1010	40,0	37,5	0	62,5	21,9
12	Б-2 B. circulans	8,5 × 108	60,0	58,3	41,7	0	100
13	Б-12 B. licheniformis	4,8 × 1010	60,0	16,6	16,7	66,7	16,6
14	3-3 Bacillus sp.	3,4 × 1010	20,0	25,0	0	75,0	6,3
15	11-3 Bacillus sp.	3,6 × 1010	80,0	68,7	0	31,3	60,9

Максимальная всхожесть семян отмечена в вариантах с бактериями D 1-1 и 11-3 Bacillus sp. (80,0 %); Fa 4-1 B. subtilis и D 7-3 Bacillus sp. (65,0 %); K 1-2 Bacillus sp., Б-2 B. circulans, Б-12 B. licheniformis (60,0 %).

У взошедших растений льна максимальную эффективность лабораторных образцов по поражению корней возбудителем фузариоза показали шесть штаммов: Б-2 B. circulans (100 %), K 1-2 Bacillus sp. (68,8 %), Fa 4-2 Bacillus sp. (64,3 %), 11-3 Bacillus sp. (60,9 %) и D 1-1 Bacillus sp. (53,1 %), D 7-3 Bacillus sp . (51,9 %).

Высокая эффективность лабораторных образцов по поражению корней и одновременно максимальная всхожесть семян установлена у пяти штаммов: 11-3, D 1-1, K 1-2 и D 7-3 Bacillus sp., Б-2 B. circulans (рис. 2) .

а           б                в

Рисунок 2 – Всхожесть семян льна масличного, обработанных лабораторными образцами микробиопрепаратов на основе перспективных штаммов бактерий из рода Bacillus на фоне искусственного заражения возбудителем фузариоза Fusarium oxysporum var. orthoceras в почвосмеси, через 20 суток, 2019 г. (ориг.): а – контроль без обработки;

б – 11-3 Bacillus sp .; в – D 1-1 Bacillus sp.

Из семи перспективных штаммов бактерий из рода Pseudomonas высокая всхожесть семян льна на жестком фоне поражения возбудителем фузариоза отмечена у четырех штаммов (табл. 3).

Таблица 3

Эффективность обработки семян льна масличного лабораторными образцами микробиопрепаратов на основе перспективных штаммов бактерий антагонистов из рода Pseudomonas на фоне искусственного заражения возбудителем фузариоза Fusarium oxysporum var. orthoceras в почвосмеси, через 20 суток г. Краснодар, ЦЭБ, ВНИИМК, 2019 г.

№ п/п	Вариант	Титр, КОЕ/мл	Всхо жесть, %	Поражено фуза-риозом корней, %, по баллам			Биологическая эффективность, % (по 2-му баллу)
				0	1	2
1	Контроль без инфекции	-	75,0	0	0	0	-
2	Контроль с инфекцией	-	17,5	20,0	0	80,0	-
3	Sgc-1 Pseudomonas sp.	2,5 × 1011	80,0	75,0	0	25,0	68,8
4	12-2 Pseudomonas sp.	1,8 × 1011	50,0	40,0	10,0	50,0	37,5
5	15-1 Pseudomonas sp.	1,5 × 1011	35,0	42,9	0	57,1	28,6
6	Sgrc-1 P. fluorescens	3,5 × 1011	25,0	20,0	20,0	60,0	25,0
7	14-3 P. chlororaphis	3,8 × 1011	75,0	60,0	13,3	26,7	66,6
8	14-4 Pseudomonas sp.	2,5 × 1011	45,0	44,5	11,1	44,4	44,5
9	16-2 Pseudomonas sp.	1,8 × 1011	60,0	25,0	16,7	58,3	27,1

Максимальная всхожесть семян отмечена в вариантах с бактериями: Sgc-1 Pseudomonas sp. (80,0 %), 14-3 P. chlororaphis (75,0 %) (рис. 3).

а          б                в

Рисунок 3 – Всхожесть семян льна масличного, обработанных лабораторными образцами микробиопрепаратов на основе перспективных штаммов бактерий из рода Pseudomonas на фоне искусственного заражения возбудителем фузариоза Fusarium oxysporum var. orthoceras в почвосмеси, через 20 суток, 2019 г. (ориг.): а – контроль без обработки;

б – Sgc-1 Pseudomonas sp. ;

в – 14-3 P. chlororaphis

У взошедших растений льна максимальную эффективность лабораторных образцов по поражению корней возбудителем фузариоза показали два штамма: Sgc-1 Pseudomonas sp. (68,8 %) и 14-3 P. chlororaphis (66,6 %). При этом у этих же штаммов отмечена одновременно максимальная эффективность препаратов по поражению корней возбудителем фуза-риоза и высокая всхожесть семян.

Выводы. В результате второго этапа вторичного скрининга 32 перспективных штаммов антагонистов к возбудителю фузариоза льна масличного Fusarium oxysporum var. orthoceras в почвосмеси выделен 21 перспективный штамм-продуцент микробиопрепаратов, показавший высокую всхожесть семян и биологическую эффективность по поражению корней, превышающую 50,0 %. При этом у девяти штаммов-продуцентов микробиопрепаратов установлена одновременно высокая эффективность по поражению корней возбудителем фузариоза и макси- мальная всхожесть семян.

Из 12 перспективных грибных штаммов одновременно максимальная всхожесть семян и высокая эффективность лабораторных образцов по поражению корней возбудителем фузариоза установлена у двух штаммов – Т-1 Trichoderma sp. (70,0 и 64,3 % соответственно) и И-3 Basidio-mycetes (60,0 и 100 % соответственно).

Из 13 перспективных штаммов бактерий рода Bacillus одновременно максимальная всхожесть семян и высокая эффективность лабораторных образцов по поражению корней установлена у пяти штаммов: 11-3 Bacillus sp. (80,0 и 60,9 % соответственно), D 1-1 Bacillus sp. (80,0 и 53,1 % соответственно), D 7-3 Bacillus sp. (65,0 и 51,9 % соответственно), K 1-2 Bacillus sp. (60,0 и 68,8 % соответственно) и Б-2 B. circulans (60,0 и 100 % соответственно).

Из семи перспективных штаммов бактерий рода Pseudomonas у двух штаммов отмечена одновременно высокая всхожесть и максимальная эффективность лабораторных образцов по поражению корней возбудителем фузариоза: Sgc-1 Pseudomonas sp. (80,0 и 68,8 % соответственно) и 14-3 P. chlororaphis (75,0 и 66,6 % соответственно).

Все выделенные перспективные штаммы антагонистов будут включены в следующий этап скрининга против возбудителя фузариоза льна масличного.