Выбор оптимальной технологии получения экстракта Crocus alatavicus с высоким содержанием флавоноидов и каротиноидов

УДК 615.451.16                            

Введение.

Род Crocus L., насчитывающий более 80 видов, принадлежит к семейству Iridaceae Juss . Наиболее известным видом является Crocus sativus L., известный как шафран, который представляет собой одну из самых дорогих травяных специй в мире, получаемую из рыльцев цветков данного растения. Шафран находит широкое применение не только в кулинарии, но и в фармацевтической и косметической отраслях.

Результаты поиска в базе данных Scopus выявили 3723 научные статьи по ключевому слову « Crocus ». Большинство из них посвящены изучению фармакологических свойств и химического состава растений рода Crocus L. Наблюдается значительный рост объема исследований с 2007 года.

Результаты исследований in vitro и in vivo показывают, что внимание к фармакологической активности шафрана и других видов крокусов сосредоточено на антиоксидантной, противовоспалительной, противоопухолевой и кардиопро-текторной активности [1-5]. Химический состав растений рода Crocus L. включает как первичные метаболиты (углеводы, белки, жиры, минералы и витамины), так и вторичные метаболиты, такие как каротиноиды, флавоноиды и терпеноидами [6, 7]. Качество шафрана на рынке определяется концентрацией трех основных метаболитов, обеспечивающих его уникальный цвет, вкус и аромат: кроцина, пикрокроцина и сафра-нала. Следовательно, основные научные исследования, касающиеся C. sativus, сосредоточены на анализе химического состава шафрана, вклю- чая кроцин, пикрокроцин и сафранал, которые влияют на его качественные характеристики [8].

В растениях рода Crocus L. производные флавоноидов составляют значительную долю вторичных биологически активных веществ. Ключевыми флавоноидами в нативных таксонах Crocus L. являются кемпферол и кверцетин, а также их производные. Широкий спектр фармакологической активности растений данного рода обусловлен наличием вышеупомянутых соединений.

Многочисленные исследования подтвердили антиоксидантные свойства экстрактов и вторичных метаболитов шафрана. Метанольный экстракт шафрана демонстрирует высокую антиоксидантную активность, при этом кроцин, пикрокроцин и сафранал эффективно удаляют свободные радикалы [9]. Сафранал и кроцин способны захватывать свободные радикалы, в то время как кроцетин проявляет значительную эффективность в удалении свободных радикалов и ингибировании перекисного окисления липидов. Эти свойства предполагают их потенциальное применение в профилактике рака, а также в терапии сердечно-сосудистых и психических расстройств [10].

Дополнительные исследования подтвердили антиоксидантные свойства водных и этанольных экстрактов шафрана. Этанольные экстракты обладают активностью по поглощению радикалов и способствуют деградации дезоксирибозы, тогда как водные и этанольные экстракты ингибируют перекисное окисление липидов в эритроцитах и образование малонового диальдегида [11]. Исследования in vivo также показали, что шафран проявляет антиоксидантную активность в эпителиальных клетках бронхов мышей с астмой [12]. Более того, шафран и его активный ингредиент кро-цин могут предотвращать окислительное повреждение мозга, печени и почек, вызванное хроническим стрессом у крыс [13]. В другом исследовании было установлено, что водный экстракт шафрана не только обладает антиоксидантной активностью, но и способен блокировать активные формы кислорода, а также ингибировать активацию внутриклеточных сигналов, что приводит к подавлению апопто-тического пути и улучшению жизнеспособности клеток [14].

В последние десятилетия накоплено множество доказательств, подтверждающих также противоопухолевых свойств шафрана и его основных компонентов, отвечающих за органолептические характеристики. Исследо- вания китайских ученых [15] изучили эффект и механизм действия кроцинов I и II против клеточных линий рака легких A549 и H446. In vitro анализы показали, что клеточная пролиферация и апоптоз изменяются в зависимости от дозы и времени воздействия. В ходе in vivo исследований, при пероральном введении экстрактов шафрана мышам в дозе 100 мг/кг/сут в течение 28 дней, наблюдалось уменьшение размера опухоли ксенотрансплантата, что связано с каскадным механизмом, опосредованным каспазами-8, -9 и -3.

Результаты in vitro исследований продемонстрировали, что кроцин из гималайского крокуса значительно снижает жизнеспособность клеток рака толстой кишки (HT-29, Caco-2) [16]. Эти данные были подтверждены в последующих in vivo исследованиях, где обработка мышей с опухолями высокими дозами (150 мг/кг) кроцина ингибировала ангиогенез и рост опухоли толстой кишки. Авторы [17] также отметили, что этанольный экстракт C. sativus демонстрирует выраженную цитотоксическую активность в отношении клеточных линий HeLa и HepG2.

Таким образом, основными группами действующих веществ экстракта, представляющими интерес, являются каротиноиды и флавоноиды.

Цель настоящего исследования заключается в выборе оптимального метода экстракции для получения извлечений с максимальным содержанием флавоноидов и каротиноидов из надземной части Crocus alatavicus .

Crocus alatavicus Regel et Semen. – является эндемиком Тянь-Шаня, встречается в Джунгарском Алатау, Заилийском Алатау, Кетмене, Кунгей и Терскей Алатау, Каратау и Западном Тянь-Шане. Произрастает на щебенистых и глинистых склонах, луговых и степных участках, в зарослях кустарников от предгорий до верхней границы лесного пояса. В 2018 году нами были проведены культивирования методом семенного размножения на плантации фармацевтической компании ТОО «Фитолеум», что дало положительные результаты, и на настоящий момент растения успешно прижились [18].

Материалы и методы исследований

Объектом исследования является высушенное растительное сырье, полученное из надземной части культивированного Crocus alatavicus Regel et Semen. Для получения экстракта были применены методы экстрагирова- ния: мацерация, мацерация с применением ультразвука и перколяция.

Методика экстракции.

• • для получения флавоноидно-каротиноидного экстракта методом мацерации, измельченное воздушно-сухое сырье - Crocus alatavicus , заливали пятикратным избытком (по объему) хлороформа и оставляли в экстракторе для настаивания при комнатной температуре на 48 часов, после чего экстракт отфильтровывали и концентрировали досуха в мягких условиях (температура 40-50⁰С, вакуум водоструйного насоса).

• • для получения флавоноидно-каротиноидного экстракта методом мацерации с ультразвуком, измельченное воздушно-сухое сырье - Crocus alatavicus, заливали пятикратным избытком (по объему) хлороформа и оставляли в экстракторе для настаивания при комнатной температуре на 24 часа, в течении процесса через каждый 8 часов по 20 минут воздействовали ультразвуком частотой колебаний 30 кГц.

• • для получения флавоноидно-каротиноидного экстракта методом перколяции, измельченное воздушно-сухое сырье - Crocus alatavicus , заливали в двухкамерном перколяторе трехкратным (по объему) избытком хлороформа и оставляли на 24 часа без перемешивания. После чего в перколятор добавляли экстрагент до «зеркала» и выдерживали еще 48 часов. Экстрагирование протекало в два приема: первую порцию в количестве 85% (концентрированная вытяжка) по отношению к массе сырья собирали в отдельную емкость, затем подставляли другую емкость и вели перколяцию до полного истощения сырья (разбавленная вытяжка). Полученные экстракты объединяли отфильтровывали и концентрировали досуха в мягких условиях (температура 40-50⁰С, вакуум водоструйного насоса).

Методика хроматографирования.

Анализы полученных    экстрактов проводили на газовом хроматографе с масс- спектрометрическим детектором 6890N/5973C (Agilent, США), оснащенном автосамплером Combi-PAL (CTC Analytics, Швейцария). Для ГХ-МС анализа 1.00 мкл образца вводили в инжектор газового хроматографа при помощи автосамплера при температуре инжектора 250°С. Хроматографирование проводили с использованием капиллярной колонки HP-5ms (Agilent, США) длиной 30 м, внутренним диаметром 0.25 мм и толщиной пленки 0.25 мкм при постоянной скорости газа-носителя (гелий, >99.995%, Оренбург-Техгаз, Россия), равной 1,0 мл/мин. Программа нагрева хроматографической колонки: выдержка 5 мин при 40°С, нагрев со скоростью 10°С/мин до 280°С, выдержка 5 мин. Полное время хроматографирования – 34 мин. Температуры квадруполя и источника ионов МСД составляли 150 и 230°С, соответственно.

Масс-спектрометрическое детектирование кверцетина и бета-каротина проводили в режиме сканирования ионов в диапазоне m/z от 40 до 650 в задержкой растворителя 5 мин. Идентификацию пиков, обнаруженных на хроматограммах, проводили при помощи библиотек масс-спектров NIST’11 и Wiley 10.

Результаты и их обсуждение

При выборе оптимальной технологии экстрагирования флавоноидно-каротиноидно-го экстракта сложность задания заключалась в том, что в практически полном несовпадении по растворимости флавоноидов и каротиноидов. Из разрешенных в технологии лекарственных форм растворителей, в достаточной степени извлекающих оба целевых класса растительных веществ, были выбраны хлороформ для мацерации (в том числе ультразвуковой) и перколяции. Результаты газовой хроматографии представлены на рисунках 1-3 и в таблице 1.

Рисунок 1. ГХ-хроматограмма сухого экстракта Crocus alatavicus , полученного методом мацерации

Рисунок 2. ГХ-хроматограмма сухого экстракта Crocus alatavicus , полученного методом ультразвуковой мацерации

Рисунок 3. ГХ-хроматограмма сухого экстракта Crocus alatavicus , полученного методом перколяции

Таблица 1. Сравнительная таблица содержания кверцетина и бета-каротина в сухих экстрактах Crocus alatavicus

№	Метод экстракции	Время удерживания, мин		Содержание в экстракте, %
		кверцетин	β-каротин	кверцетин	β-каротин
1	48 ч. мацерация CHCl 3	1.592	1.722	1.236	1.561
2	24 ч. мацерация CHCl 3 с ультразвуком 30 кГц	1.592	1.722	6.849	4.723
3	72 ч. перколяция CHCl 3	1.591	1.721	1.147	4.658

Содержание суммы флавоноидов рассчитывали в пересчете на кверцетин, а сумму каротиноидов - в пересчете на β-каротин. Максимальные показатели кверцетина (6,849 %) и β-каротина (4,723 %) были обнаружены при экстракции методом мацерации с ультразвуком. Основываясь на данных зарубежных авторов, нами были выбраны параметры: продолжительность экстрагирования - 24 часа, воздействие ультразвука - через каждые 8 часов по 20 минут, частота колебаний 30 кГц. Эффективность метода объясняется тем, что ультразвуковой способ обеспечивает более глубокое проникновение растворителя в клеточную структуру материала, что приводит к увеличению скорости процесса и позволяет экстрагировать термолабильные соединения. Увеличение указанных параметров может привести к разрушению мембран и значительному выходу балластных веществ в экстракт. Увеличение коэффициента внутренней молекулярной диффузии при прочих равных условиях возможно за счет уменьшения размера частиц экстрагируемого материала [19, 20].

Заключение, выводы

Таким образом, оптимальным методом экстрагирования для получения флавоноиднокаротиноидного экстракта является ультразвуковая мацерация. На основании анализа полученных результатов предложен эффективный режим экстрагирования, позволяющий получить извлечения с высоким содержанием суммы флавоноидов и каротиноидов: экстрагент – хлороформ; модуль экстракции 1:5; метод экстракции – мацерация с применением ультразвука частотой 25 кГц; время экстракции 24 часа, продолжительность воздействия ультразвуком – 3 раза по 20 минут; температура процесса 25 С.