Анализ микологического исследования кожных покровов рептилий, содержащихся в условиях неволи

Многие виды животных являются естественным резервуаром микроскопических грибов и источником заражения для человека, что обуславливает тесную взаимосвязь заболеваемости микозов среди людей и животных. Зоофильные виды микозов во многих странах в настоящее время доминируют в этиологической структуре микозов человека. Выявление и нейтрализация путей распространения грибковых инфекций, общих для человека и животных, является важной социально-значимой задачей медицинских и ветеринарных служб [1].

Холоднокровные животные, в отличие от млекопитающих и птиц, в силу своих физиологических особенностей имеют естественную предрасположенность к миконосительству. Большая часть грибковой микрофлоры рептилий относится к субпатогенным организмам, в основном сапрофитам [2]. Их, как правило, изолируют с кожи совершенно здоровых рептилий. К примеру, Aspergillus и Penicillium культивируют с кожи почти 78 % [3] здоровых животных. При этом переход из скрытого носительства в клиническую стадию происходит крайне редко. Главными факторами для начала проявления болезни являются плохие условия содержания рептилий и неправильный уход за ними.

Это приводит к снижению естественной резистентности организма и является одной из причин массового распространения грибов, являющихся как патогенной, так и условно-патогенной микрофлорой. В ряде случаев именно обычная микрофлора приобретает большое значение в возникновении или развитии болезни, способствуя либо препятствуя ее проявлению. Иногда обычная микрофлора становится источником тех патогенных или условно-патогенных заразных агентов, которые обуславливают эндогенное инфицирование, проявление секундарных инфекций. Однако существуют ситуации, когда многие бактериальные и грибковые агенты вызывают заболевания даже в оптимальных условиях содержания животных [4, 5].

При этом нормальная микрофлора рептилий содержит много видов грибков. При обследовании микрофлоры кишечника 29 африканских карликовых крокодилов (Osteolaemus tetraspis) было выделено 20 видов грибков [6]. Из кишечника двухсот обычных агам (Agama agama) был выделен Basidiobulus, Aspergillus (Аспергиллез), Candida (кандидоз), Penicillium (пенициллиоз), Fusarium и Mucor. [7]. Дрожжеподобные присутствуют в кишечнике змеевидных у травоядных зелёных черепах и ящеровидных [8,9]. Дрожжевые были обнаружены в кишечнике, а также на коже, в глазах, печени, в меньшей степени в лёгких и почках [8]. Культура дрожжевых или сапрофитных оппортунистических грибков из экскрементов рептилий не клинически значима, если речь не идёт о желудочно-кишечных признаках, септированных гифах грибков, или же о клетках почкующихся дрожжей, которые видны на фекальном мазке.

Условно микозы разделяют на поверхностные (дерматомикозы) и глубокие (системные), и те и другие могут быть локальными или диссеминированными [10, 11]. Диагностика их в современной ветеринарной медицине до сих пор затруднительна, глубокие нагноения или соматические микозы часто протекают как скрытые инфекции, медленные, прогрессирующие. Их трудно распознать и, следовательно, они остаются не выявленными до тех пор, пока не применят лапароскопическую диагностику, или пока это не выявится на патологоанатомическом вскрытии трупа. Проще выявить микозы кожи, но они практически неотличимы от кожных поражений, вызванных бактериальными инфекциями, и часто ошибочно диагностируются как таковые [5].

Симптоматика поверхностных микозов чаще всего протекает в виде поражения панциря, гиперкератоза, помутнении и изменении рогового слоя. Проявляются нарушением процесса линьки и изменения формы чешуек. Наиболее часто выделяют с поверхности кожи грибы рода Mucor, Candida, Fusarium [12, 13, 14, 8].

Системные микозы встречаются реже. Как правило, их обычно изолируют у крупных крокодилов и черепах. Чаще поражаются легкие с последующей генерализацией инфекции [15]. Описаны случаи первичного поражения печени, селезенки и миокарда [16]. Инфекционными агентами, как правило, являются Aspergillus, Penicillium, Paecilomyces, Fusarium и Acremonium.

Цель исследований . Проведение микологических исследований кожных покровов пресмыкающихся, находящихся в условиях неволи.

Задачи исследований . Микологический анализ поверхности кожи рептилий, содержащихся в условиях неволи. Изучение культуральных и морфологических особенностей выделенных микроскопических грибов, а также определение их родовой и видовой принадлежности. Определение патогенности путем проведения биологической пробы.

Материалы и методы исследований. Работа выполнена на базе кафедры эпизоотологии и паразитологии Института прикладной биотехнологии и ветеринарной медицины ФГОУ ВПО «КрасГАУ» в 2011 г. Исследования проводились в соответствии с планом научно-исследовательской работы и являются частью комплексных исследований по эпизоотологическому мониторингу животных по заразным болезням животных в условиях Красноярского края.

Объектом исследований являлись рептилии содержащиеся в условиях неволи в частных коллекциях города Красноярска, а именно подотряд змеи (Ophidia), семейство Ложноногие змеи (Boidae), род Настоящие питоны, вид тигровый питон (Python molurus). Материалом служили смывы с кожи животных

Исследованию подверглись 5 групп животных, каждая из которых содержится в отдельном изолированном террариуме, построенных согласно нормам и требованиям. В каждой группе по 5 особей. Средний возраст 4 года. Кормление осуществлялось в соответствии с рационами, рекомендованными учеными-герпетологами.

Смывы с кожи были сделаны специальным зонд-тампон тупфером с транспортной средой Amies. На базе лаборатории кафедры эпизоотологии и паразитологии были проведены посевы на специальные питательные среды: агар Чапека и агар Сабуро согласно методике [10]. Среды были приготовлены самостоятельно по рецептуре [17]. Посевы инкубировали в течение 10–14 дней при температуре 25–28°С. После необходимой экспозиции был изучен характер роста выделенных культур и приготовлены препараты методом «придавленная капля».

Для этого на чистое предметное нанесли каплю водного 50 % раствора глицерина, а затем иглой осторожно отбирали небольшое количество мицелия гриба, стараясь не повредить его, и внесли в каплю жидкости, аккуратно снимая его другой иглой. Препарат накрыли покровным стеклом и, оттянув избыток жидкости кусочком фильтровальной бумаги, изучили вначале под малым, а затем под большим увеличением. Идентификацию грибов проводили по определителю.

Определение токсичности грибов проводили методом пробы на коже кролика.

Результаты исследований и их обсуждение. При исследовании роста грибов на питательных средах установили, что он характеризовался большим многообразием. После изучения морфологических осо- бенностей структур клеток гриба для дальнейшей идентификации микроорганизмов воспользовались определителем грибов [18]. Видовой состав выглядит следующим образом: Mucor nigricanis, Alternaria, Aspergil-lius fumigatus, Fusarium oxysporum, Penicilium crustosum и Candida albicans, а также ныне отнесенные к проактиномицетам бактерии семейства Actinomycetales. Результаты идентификации микроскопических грибов представлены в таблице.

Результаты идентификации микроскопических грибов

Материал пробы	ю о CL С О ।— о о зг о bd	CL 1— о о о m	В том числе
			Mucor. nigricans		Aspergilius fumigatus		Alternaria		Fusarium oxysporum		Penicillium crustosum		Candida albicans
			Кол-во	%	Кол-во	%	Кол-во	%	Кол-во	%	Кол-во	%	Кол-во	%
1-я группа	5	8	3	37,5	1	12,5	2	25	-	-	-	-	2	25
2-я группа	5	12	2	17	1	8	2	17	3	25	3	25	1	8
3-я группа	5	11	2	18	2	18	2	18	2	18	2	18	1	10
4-я группа	5	13	3	23,5	1	8	2	15	2	15	2	15	3	23,5
5-я группа	5	12	2	17	2	17	2	17	4	33	1	8	1	8
Всего	15	56	12	21	7	12,5	10	18	11	20	8	14,25	8	14,25

Mucor относится к низшим совершенным грибам класса Zygomycetes. Является возбудителем Мукор-микоза. В процессе лабораторных исследований встречался наиболее часто (рис. 1). В чашках Петри наблюдали в виде войлочных пушистого, врастающего в среду, мицелия темно-коричневого и черного цвета (рис. 1, 5). На микропрепарате структура гриба представлена одноклеточным мицелием, от которого отходит спорангиеносец, на конце которого находится шаровидный спорангий с овальными эндоспорами (рис. 2).

Обзор грибковой микрофлоры кожи рептилий

14,25%

• ■    Mucor

• ■    Aspergillius

• ■    Penicillium

• ■    Fusarium

• ■    Alte rnaria

  

  Рис. 1. Макрокартина Mucor nigricans

  
  

Рис. 2. Микрокартина Mucor nigricans Увеличение Х 400

В результате исследований идентифицировали гриб из рода Alternaria – класс высших грибов. Это условно-патогенный сапрофит. Строма бесцветная. При нашем исследовании на агаре Сабуро – это черные бархатистые колонии с небольшими белыми центрами (рис. 3). Под микроскопом мы наблюдали неправильной формы конидии с поперечными перегородками, напоминающими гранату или лимонку (рис. 4).

Рис. 3. Макрокартина Alternaria

Рис. 4. Микрокартина конидии Alternaria. Увеличение Х 400

При идентификации обнаружили гриб из рода Aspergillius, который относится к классу высших грибов и способный вызывать аспергиллез различных видов животных. У Aspergillius fumigatus на агаре Сабуро наблюдался рост в виде широко распространяющихся бархатистых колоний (рис. 5). Конидиеносцы прямостоящие, большей частью не ветвящиеся, с перегородками в нижней части. Боковые стенки конидиенос-цев утолщенные, бесцветные, гладкие или шероховатые. На конце конидиеносца находится грушевидное вздутие, несущее стеригмы. Стеригмы расположены радиально на поверхности всего вздутия (рис. 6).

Рис. 5.Макрокартина гриба Mucor nigricans, Aspergillius fumigatus , Actinomycetales

Рис. 6. Микрокартина гриба Aspergilius fumigates. Увеличение Х 400

Гриб рода Penicillium – класс высших грибов (насчитывается свыше 800 видов Penicillium). В нашем исследовании представлен плотным, почти не ветвящимся, субстратным, от светло- до темно-зеленого цвета мицелием (рис. 7). На микрокартине видны одиночные конидиеносцы, кисточки многомутомчатые, конидии круглые и эллиптические

Candida – дрожжеподобный гриб, одноклеточный микроорганизм, который образуют колонии относительно большой величины. В нашем исследовании представлен культурой округлой формы, с гладкой, слегка шероховатой, матовой поверхностью, ровными и волнистыми краями (рис. 7).

Грибы рода Fusarium вызывают заболевание фузариотоксикоз. Эта группа грибов состоит из 8 секций, и они имеют 27 видов и 28 разновидностей. На агаре Сабуро рост в виде развитого пушистого мицелия, оранжевого цвета (рис. 5, 7). Микрокартина выглядит следующим образом: конидии удлиненные, разнообразно согнутые с несколькими перегородками, образуют хламидоспоры – одиночные или в цепочках.

Рис. 7. Макрокартина грибов Penicilium crustosum и Candida albicans и Fusarium oxysporum

Для подтверждения патогенности токсинов грибов Aspergilius fumigates и Penicilium crustosum был проведен биологический метод исследования на кроликах в соответствии с методикой. Для этого животным вводили внутривенно суспензию спор грибов в объеме 0,6 х 10 ⁶ . Каждой культурой было заражено по три животных. В общей сложности было заражено 45 кроликов. По истечении 15 дней была проведена эутаназия и проведено патолоанатомическое вскрытие. При осмотре брюшной и грудной полости было отмечены прижизненные изменения органов у 15 (71 %) кроликов, зараженных спорами Аспергилиуса и 13 (54 %) животных, зараженных спорами Пеницилиума, а именно: легкие усеяны многочисленными плотными узелками величиной от просеянного зерна до фасоли, неправильной формы. На разрезе тусклые, с сухой крошащейся некротизированной центральной частью, окруженной пояском ткани серо-белого цвета. Легочная ткань, окружающая узелки, отечна, воспалена. На микропрепарате, окрашенном гематоксилин-эозином, при среднем увеличении видны альвеолы, заполненные гистиоцитами, лимфоидными клетками, слущившимся респираторным эпителием и лейкоцитами. Среди клеточных форм имеются многочисленные нити мицелия, растущего в различных направлениях. Лишь только у трех кроликов не было отмечено каких-либо изменений внутренних органов, что подтверждает патогенность культур грибов Aspergillius и Penicillium.

Выводы

• 1.    Основная грибковая микрофлора поверхности кожи рептилий, содержащихся в условиях неволи, представлена следующими видами: Mucor nigricans (21 %), Fusarium oxysporum (20 %), Alternaria (18 %), Pen-icilium crustosum (14,25 %), Candida albicans (14,25 %) , Aspergillius fumigates (12,5 %).

• 2.    При отсутствии клинических симптомов у рептилий обнаружение культур грибов аспергилиус, пе-ницилиум свидетельствует о здоровом миконосительстве как одной из форм инфекционного процесса, при котором наступает равновесие между микро- и макроорганизмом.

• 3.    Высокий процент патогенных культур Aspergillius fumigates (71 %) и Penicilium crustosum (54 %), выявленный методом биологической пробы на лабораторных животных, свидетельствует о том, что теплокровные животные могут быть чувствительны к инфицированию.