Цитофизиологический анализ начала морфогенеза в андроклинных каллусах пшеницы in vitro

Современное развитие инновационных направлений биотехнологии растений требует новых фундаментальных данных о морфогенезе как в естественных условиях, так и в культуре in vitro .

Однако интенсивные исследования морфогенеза растений затруднены интегральным характером морфогенетических процессов, зависимостью их от многих внутренних и внешних факторов и их взаимодействий [1].

Принципиально важное свойство морфогенеза – универсальность его путей как в естественных условиях in vivo , так и в условиях культуры in vitro [2]. Такая универсальность позволяет выбрать более простую, чем целый организм, модель для изучения особенностей морфогенетических процессов, например, пыльник [3].

Удобной моделью могут служить каллусы, в том числе андроклинные, полученные в культуре in vitro изолированных пыльников из микро-спор/клеток пыльцевого зерна на основе биологического феномена андрогенеза in vitro , или, корректнее, андроклинии [4].

Не смотря на то, что к настоящему времени накоплен значительный фактический материал, касающийся различных аспектов исследования анд-роклинных каллусов [5], многие вопросы остаются открытыми. Так, до сих пор не выявлены инициальные клетки/группы клеток андроклинных каллусов, в которых индуцируются пути морфогенеза in vitro , и факторы, стимулирующие морфогенез этих клеток. Далеким от окончательного решения остается и вопрос об участии фитогормонов в реализации морфогенетического потенциала клеток андроклинных каллусов. Полностью отсутствуют данные о локализации гормонов в каллусах (и не только андроклинных) в динамике развития in vitro.

Согласно литературным данным, необходимое условие для приобретения культивируемыми клетками каллусов злаков морфогенетической компе тентности – присутствие в питательных средах экзогенных ауксинов, роль же цитокининов при этом минимальна.

При этом морфогенетическая компетентность клеток может достаточно долго поддерживаться

при культивировании in vitro каллусов на питательных средах, содержащих в качестве гормональных добавок только экзогенные ауксины. Однако для дальнейшей дифференциации морфогенетически компетентных клеток каллусов необходимы цитокинины, причем иногда достаточно наличие только эндогенных (в составе каллуса) цитокининов [6]. Известно, что цитокинины повышают аттрагирующую способность клеток, то есть способность аккумулировать питательные вещества за счет их транспорта из других тканей [7], что, в свою очередь, по нашему мнению, может способствовать дальнейшему развитию культивируемых клеток каллуса. Кроме того, известно, что аттраги-рующая способность, как правило, характерна для меристематических клеток [7]. Исходя из этого, логично предположить, что в составе андроклин-ных каллусов имеются меристематические клетки, являющиеся инициальными при реализации различных путей морфогенеза in vitro , и характеризующиеся преимущественной локализацией в них цитокининов. В связи с этим цель данной работы заключалась в выявлении локализации цитокининов в клетках развивающихся in vitro андроклин-ных каллусов яровой мягкой пшеницы.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

В качестве материала для исследования использовали гибридную линию яровой мягкой пшеницы Фотос, характеризующуюся высокой частотой образования in vitro андроклинных каллусов. Для получения андроклинных каллусов использовали метод культуры in vitro изолированных пыльников, модифицированный с учетом эмбриологических нюансов [8].

Цитокинины в клетках андроклинных каллусов выявляли методом иммунолокализации фитогормонов с помощью антител, меченных коллоидным золотом [9].

Постоянные препараты, полученные согласно общепринятой методике [10], просматривали с применением микроскопа проходящего света Axio Imager.A1 (Carl Zeiss, Jena).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В культивируемых андроклинных каллусах пшеницы наблюдали следующие пути морфогенеза in vitro: эмбриоидогенез – формирование эмбриоидов (зародышеподобных структур), гемморизогенез (формирование почки и корня), геммогенез (формирование почки), ризогенез (формирование корня). Именно такие же пути морфогенеза in vitro клеток андроклинных каллусов были выявлены нами ранее на примере других сортов и гибридных линий яровой мягкой пшеницы [11, 12], а также в культуре in vitro каллусов зародышевого происхождения у ряда сортов яровой мягкой пшеницы [13]. Такие наблюдения еще раз дают основания поддержать положение об универсальности путей морфогенеза растений как в естественных условиях in vivo, так и в культуре in vitro.

Сопоставление данных детального цито-гистологического анализа всех путей морфогенеза in vitro андроклинных каллусов пшеницы показало, что начальный этап всех путей универсален и состоит в обособлении в каллусе зоны меристематических клеток, отличающихся от остальных клеток каллуса плотной цитоплазмой и центральным расположением ядра. Для этих клеток характерны интенсивные деления. Такая зона клеток обозначена нами как морфогенетический очаг (рис.).

Методом иммунолокализации гормонов установлено, что цитокинины локализуются преимущественно именно в клетках такой меристематической зоны (рис., б ), тогда как клетки периферической зоны не демонстрируют специфическую окраску на цитокинины.

Рис. Локализация цитокининов в морфогенетическом   б – наличие специфической окраски на цитокинины.

очаге андроклинного каллуса пшеницы : а – контроль, Установлено, что в ходе дальнейшего развития андроклинных каллусов в условиях in vitro цитокинины локализуются также преимущественно в клетках меристематической зоны, и, кроме того, в клетках развивающихся органов (апексов побега и корня) и клетках развивающихся эмбриоидов (вплоть до глобулярной стадии развития эмбриоида).

Таким образом, нами проведен детальный цито-гистологический анализ всех выявленных путей морфогенеза in vitro андроклинных каллусов в сопоставлении с данными локализации цитокининов.

Полученные данные продемонстрировали участие этих фитогормонов именно на начальных этапах всех путей морфогенеза in vitro , связанных с активными митотическими делениями и дифференциацией клеток меристематической зоны каллуса. Более того, самый начальный этап всех путей морфогенеза in vitro андроклинных каллусов универсален и состоит в обособлении в каллусе центральной меристематической зоны, преимущественно в клетках которой локализуются цитокинины. Такие данные еще раз подтверждают важную (и, по-видимому, определяющую) роль цитокининов в индукции митотической активности и дифференциации клеток как в естественных условиях [14], так и в условиях культуры in vitro [15].

Таким образом, преимущественная локализация цитокининов в клетках меристематических зон ан-дроклинных каллусов является одним из основных факторов, влияющих на дальнейшую дифференциацию клеток при морфогенезе in vitro .

Исследование поддержано грантом РФФИ № 08-04-97045 и программой «Ведущие научные школы РФ» (грант № НШ 7637.2010.4, лидер Школы – член-корр. РАН Т.Б. Батыгина, БИН РАН, Санкт-Петербург).