Цитологическая оценка динамики репаративных процессов в ранах у кроликов при использовании классического метода лечения мазью «Левомеколь»

Актуальность

Проблема заживления кожных ран у лабораторных животных остаётся одной из ключевых задач экспериментальной и клинической ветеринарии. Повреждение кожного покрова сопровождается сложным каскадом клеточных и молекулярных событий, включающих воспаление, пролиферацию, ремоделирование ткани и контроль микробной контаминации. По данным A. Grada и соавторов, кролики являются надёжной моделью для изучения процессов репарации и эффективности новых терапевтических подходов [10].

Широкое распространение получили подходы с применением ло- кальных средств, способствующих стимуляции грануляции, антимикробной защите и ускорению эпителизации. B.G. Campbell указывает на эффективность мазевых препаратов при лечении инфицированных ран у кроликов [1]. Особенно важны средства, обладающие как про-тивомикробным, так и репаративным действием. В этом контексте мазь «Левомеколь», содержащая хлорамфеникол и метилурацил, используется как стандарт лечения и служит надёжной точкой сравнения в экспериментальных моделях.

Ряд авторов подчеркивает значимость цитологического контроля для оценки фаз воспаления, клеточного состава и динамики репарации [2, 9]. Цитограмма позволяет оперативно оценить доминирующий тип клеток – нейтрофилов, макрофагов, лимфоцитов или фибробластов – и тем самым судить о фазе воспаления или регенерации.

Дополнительную значимость приобретают методы морфометрического и бактериологического контроля. W. Zhang и соавторы показали, что бактериальная обсеменённость оказывает прямое влияние на скорость эпителизации и переход в фазу восстановления [4]. Использование цитологических мазков-отпечатков позволяет визуально оценивать степень микробной инвазии и уровень воспалительной инфильтрации, что особенно ценно в динамических наблюдениях [11, 12].

Также внимание исследователей привлекает эффективность средств на основе хитозана и плазменных продуктов, способствующих стимуляции ангиогенеза и формированию новой ткани [3, 6, 7, 8]. Эти работы подтверждают активное развитие направления локального патогенетического воздействия при раневой патологии.

Таким образом, анализ литературы свидетельствует о высокой актуальности цитологического подхода в исследовании динамики заживления ран и о целесообразности изучения классических схем терапии с использованием мази «Левомеколь» [5].

Цели и задачи

Целью настоящей работы является комплексная цитологическая и бактериологическая оценка динамики заживления поверхностных ран у кроликов при применении традиционного метода лечения с использованием мази «Левомеколь» для определения эффективности данного подхода на основе анализа клеточного состава мазков-отпечатков, бактериальной культуры и уровня бациллярной активности.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи исследования:

• •    провести цитологический анализ мазков-отпечатков с ран у кроликов в различные сроки лечения (на 1, 3, 5, 7 и 10 сутки) с определением морфологических типов клеток (нейтрофилы, макрофаги, лимфоциты, фибробласты, элементы эпителия), с учётом их зрелости, количества и динамики в ходе заживления;

• •    оценить динамику цитограммы - количественное и качественное изменение воспалительных и репаративных клеток, а также степень полиморфно-ядерной инфильтрации на различных этапах регенерации;

• •    провести бактериологическое исследование микрофлоры раневой поверхности, выявляя степень контаминации мазков и изменение плотности бактериальной нагрузки в динамике лечения;

• •    оценить уровень бациллярной активности (БАИ) с использованием метода на основе 5-балльной шкалы, отслеживая антибактериальный эффект терапии;

• •    определить морфологические признаки и родовую принадлежность микрофлоры, используя световую микроскопию, морфотипи-рование и особенности окрашивания по Романовскому – Гимзе;

• •    сравнить полученные результаты с данными литературных источников, оценив эффективность традиционного лечения мазью «Левомеколь» в контексте современных представлений о ранозаживляющей терапии в ветеринарной медицине.

Материалы и методы

Исследование проводилось на пяти клинически здоровых беспородных кроликах в возрасте 1 года, массой 2,0-2,5 кг. Животные содержались в стандартных условиях, с рационом, включающим комбикорм «ПК-90» и сено «разнотравье». Все манипуляции проводились в соответствии с ветеринарно-санитарными нормами. Поверхностную рану площадью 5x5 см формировали между лопатками под местной инфильтрационной анестезией. Работа была выполнена на базе кафедры анатомии, патологической анатомии и хирургии, а также зоофермы Института прикладной биотехнологии и ветеринарной медицины ФГБОУ ВО «Красноярский государственный аграрный университет».

Кролики составляли контрольную группу (n = 5), где ежедневно применялась мазь «Левомеколь» на раневую поверхность на протяжении 17 суток. Контрольные точки исследования – 3, 5, 7, 10, 12, 15 и 17 сутки. Такой протокол позволяет отследить ключевые фазы воспаления, пролиферации и репарации, как это описано в работах Hussien D. и Gentzkow B., Bayat M. [3, 5].

Методика забора материала

Цитологический материал получали методом мазка-отпечатка: стерильное предметное стекло прикладывалось к раневой поверхности, затем фиксировалось метанолом и окрашивалось по Романовскому - Гимзе. Метод рекомендован для динамического неинвазивного контроля за клеточным составом в области повреждения [9]. Выбор метода мазков-отпечатков обоснован его малой инвазивностью, возможностью многократного проведения динамического наблюдения без нанесения дополнительных повреждений тканям, а также высокой воспроизводи- мостью и доступностью в условиях лабораторной ветеринарной практики [4].

Метод цитологического исследования

Для оценки репаративных процессов и воспалительной реакции применяли метод цитологического исследования. Изучение клеточного состава мазков-отпечатков проводилось с использованием световой микроскопии (увеличение ×400, ×1000). В ходе анализа идентифицировались морфологические типы клеток: нейтрофильные гранулоциты, макрофаги, лимфоциты, клетки базального и плоского эпителия, а также элементы крови (эритроциты и тромбоциты). Данный метод позволяет с высокой чувствительностью и информативностью оценить клеточную реакцию в очаге поражения, отследить динамику воспалительного процесса, а также характер пролиферации и регенерации тканей. Именно эти параметры являются критически важными для выявления репаративного потенциала применяемой терапии, в том числе характера смены воспалительного инфильтрата на клетки грануляционной ткани. Основное внимание уделялось динамике цитограммы: смене воспалительных клеток на элементы репаративного плана (макрофаги, фибробласты), а также степени полиморфно-ядерной инфильтрации. [2]. Изучались качественные и количественные характеристики клеточного состава: доля нейтрофилов, макрофагов, лимфоцитов, эпителиоцитов, фибробластов и их зрелость. Также фиксировалось наличие и морфотип бактериальной флоры. Анализ морфотипов и их долевого соотношения позволял судить о фазах воспаления и репарации [2, 6]. Особое внимание уделялось смене полиморфно-ядерной инфильтрации на клетки грануляционной ткани как критерию эффективности проводимой терапии.

Метод оценки бациллярной активности

Для количественной и объективной оценки степени бактериальной обсемененности ран и мониторинга эффективности антимикробной терапии в динамике нами был использован метод оценки по индексу бациллярной активности. Индекс БАИ – это шкала оценки степени микробной нагрузки в мазках-отпечатках, основанная на визуальной градации количества грамотрицательной и грамположительной микрофлоры при микроскопии, что позволяет выявить интенсивность бактериальной контаминации в балльной форме. Метод имеет шкалу от 0 до 5 баллов, где:

• •    5 баллов – сплошные скопления грамотрицательной флоры;

• •    4 балла – обильная бациллярная контаминация;

• •    3 балла – умеренное количество палочек/кокков;

• •    2 балла – единичные бактерии;

• •    1 балл – минимальная микрофлора;

• •    0 баллов – бактерии не определяются.

Данный метод обеспечивает объективную количественную оценку выраженности бактериальной обсемененности раневой поверхности без необходимости проведения сложного бактериологического посева, а также позволяет сопоставлять результаты между временными точками исследования, что соответствует методическим подходам, описанным W. Zhang и соавторов [4] и B.G. Campbell [1]. Он особенно эффективен при наблюдении за динамикой процессов санации и регенерации, так как быстро и наглядно отражает изменение микробной нагрузки под влиянием терапии.

Метод определения родовой принадлежности микрофлоры

В рамках цитологического исследования мазков-отпечатков из ран проводилась морфологическая идентификация бактерий с целью определения их предположительной родовой принадлежности. В поле зрения регистрировались бактерии, оценивались их форма, размеры, окраска и расположение.

Использовалась морфологическая классификация, основанная на:

• •    форме бактерий: кокки (шарообразные), бациллы (палочки), вибрионы (изогнутые палочки), спиральные формы;

• •    характере расположения: парные (диплококки), цепочки (стрептококки), скопления (стафилококки);

• •    особенностях окрашивания: цвет цитоплазмы и ядра после окраски по Романовскому – Гимзе (что позволяет ориентироваться на грам-статус бактерий – грамположительные обычно окрашиваются в синие или фиолетовые тона, грамотрицательные – в розово-красные);

• •    размере клеток - визуально оценивался диаметр и длина бактериальных форм, что позволяло исключать или предполагать определённые роды.

• •    Интерпретация результатов

• •    На основании морфотипа и окраски бактерий, производилась предварительная родовая атрибуция микроорганизмов, например:

• •    стафилококки - грамположительные кокки, образующие скопления;

• •    стрептококки - грамположительные кокки в цепочках;

• •    бациллы (Bacillus spp.) - грамположительные палочки, часто с эндоспорами;

• •    энтеробактерии - грамотрицательные палочки, равномерно окрашенные, разбросанные или в параллельных группировках.

Идентификация носила ориентировочный характер, но была достаточной для динамического анализа микрофлоры в процессе лечения. Выбор метода обусловлен необходимостью оценки динамики микрофлоры в режиме реального времени, без необходимости культивирования, что особенно ценно для серийных наблюдений у подопытных животных.

Методика расчёта площади бактериальной колонизации

Для количественной оценки степени бактериальной контаминации в мазках-отпечатках применялся метод бактериоскопического анализа, основанный на измерении площади микробной колонизации (в мм²) в фиксированном поле зрения микроскопа.

Этапы проведения расчёта

• 1.    Подготовка и окрашивание мазков: мазки-отпечатки с поверхности ран у экспериментальных животных готовились стандартным способом и окрашивались по Романовскому – Гимзе для визуализации бактериальных тел.

• 2.    Микроскопирование: анализ проводился при увеличении ×1000 в иммерсионной системе. Изучались не менее 10 полей зрения на каждый мазок, равномерно распределённых по площади препарата. Это позволяло избежать искажения результатов из-за локальной агрегации бактерий.

• 3.    Фиксация и перевод изображения: с помощью цифровой камеры (приставка к микроскопу) фиксировались изображения полей зрения. Далее фотографии экспортировались в программное обеспечение для морфометрического анализа (ImageJ, ZEN).

• 4.    Выделение контуров бактериальных скоплений: в программной среде производилась полуавтоматическая обводка зон бактериальных скоплений на изображении. При этом учитывались только скопления визуализированных микроорганизмов, без включения клеточных элементов.

• 5.    Расчёт площади: программа автоматически определяла площадь выделенных зон с бактериальной флорой в каждом поле зрения, переводя её в абсолютные единицы (мм² или мкм²) с последующим переводом в сантиметры квадратные (см²) для единообразия.

• 6.    Агрегация данных: средняя площадь бактериальной колонизации рассчитывалась по каждому животному в каждой контрольной точке (день 1, 3, 5, 7, 10) и вносилась в итоговую таблицу. Полученные значения использовались для построения графика динамики бактериальной нагрузки. Методика оценки площади бактериальной колонизации позволила объективно и количественно проследить снижение микробной нагрузки в динамике, под воздействием терапии. Это дополнило шкалу бациллярной активности и обеспечило высокую достоверность результатов.

Результаты

В ходе исследования были проанализированы цитологические и бактерископические изменения в мазках-отпечатках ран у кроликов контрольной группы, получавших лечение мазевой повязкой с препаратом Левомеколь. Мазки анализировались в динамике на 1-е, 3-е, 5-е, 7-е и 10-е сутки.

Цитологический анализ выявил отчетливую фазность репаративного процесса. На ранних сроках (1–3 сутки) в мазках преобладали нейтрофильные гранулоциты, свидетельствующие об остром воспалительном процессе. Часть нейтрофилов имела признаки дегенерации и вакуолизации, что отражало активный фагоцитоз в очаге повреждения. Наряду с этим наблюдались единичные лимфоциты и макрофаги. Базофильные клетки и элементы плоского эпителия практически отсутствовали.

К 5-м суткам цитограмма демонстрировала снижение доли нейтрофилов, наряду с ростом количества макрофагов и лимфоцитов. Начали появляться молодые фибробласты, что указывало на переход воспалительной реакции в фазу пролиферации. Также отмечено увеличение числа эпителиальных клеток, в том числе базального типа, отражающих восстановление покровных структур.

К 7-м и 10-м суткам цитологическая картина свидетельствовала о нормализации клеточного состава: на фоне снижения нейтрофильной инфильтрации преобладали макрофаги, лимфоциты и зрелые фибробласты. Уменьшилась деструкция клеток, что коррелировало с завершением фазы воспаления и развитием репарации. Бактериологический анализ мазков-отпечатков позволил определить морфотипы бактерий и их родовую принадлежность. Результаты оценки цитологических и бактериальных структур в мазках-отпечатках представлены в таблице 1.

Таблица 1 – Цитологическая и бактериометрическая характеристика мазков-отпечатков в динамике наблюдения

День наблюдения	Бациллярная активность (баллы)	Преобладающие бактерии	Морфология клеток
31.01	3.5	кокки, диплококки	нейтрофилы, лизированные элементы
05.02	3.0	кокки	нейтрофилы, макрофаги
07.02	2.5	кокки, цепочки стрептококков	макрофаги, лимфоциты
10.02	2.0	единичные палочки, кокки	макрофаги, фибробласты
12.02	1.5	единичные кокки	фибробласты, эпителиоциты
15.02	1.0	единичные бактероиды	зрелые фибробласты
17.02	0.5	бактерии не определяются	эпителиальные клетки

Бактериоскопический анализ

На 1-е и 3-и сутки в мазках выявлялись преимущественно грамо-трицательные палочки, морфологически соответствующие бактериям рода Pseudomonas и Proteus, а также кокковая флора (Staphylococcus spp.). Колонизации носили массивный характер и покрывали значительную площадь мазка.

Начиная с 5-х суток, наблюдалась тенденция к снижению бактериальной нагрузки. К 7-му дню мазки содержали преимущественно грамположительные кокки в небольшом количестве, а к 10-му дню в большинстве случаев бактериальная флора либо не определялась, либо фиксировались единичные бактериальные тела. Для оценки динамики антимикробного эффекта терапии применялся индекс бациллярной активности (БАИ). На 1-е сутки среднее значение составляло 3,6 балла (обильная бациллярная контаминация), тогда как к 10-м суткам показатель снизился до 0,6 баллов, отражая выраженное угасание бактериальной инвазии.

График 1 демонстрирует линейное снижение площади бактериальной колонизации на поверхности мазков (рисунок 1) . К 1-м суткам площадь составляла около 9,5 см², к 10-м суткам – менее 1 см².

Рисунок 1 – Динамика бактериальной нагрузки при лечении мазью «Левомеколь» (площадь колонизации, см²)

График 2 отражает снижение показателей бациллярной активности: с 3,6 до 0,5 баллов по шкале, что подтверждает выраженный антисептический эффект мази Левомеколь (рисунок 2).

Рисунок 2 – Динамика бациллярной активности в баллах (0–5) по дням наблюдения

На 5 сутки сохранялась выраженная нейтрофильная инфильтрация (60–65 %), однако начали появляться единичные макрофаги и лимфоциты. Фон становился менее разрушенным, снижалась плотность микрофлоры (до 2–3+), преимущественно кокковой морфологии. Отмечалось уменьшение количества лизированных клеток, начались признаки фагоцитарной активности макрофагов.

К 7 суткам наблюдалась смена цитологической картины: доля макрофагов увеличивалась до 35 %, появлялись молодые фибробласты, наблюдалось снижение нейтрофилов до 25–30 %. Фон становился чище, бактериальная нагрузка снижалась до 2+, микрофлора располагалась реже и преимущественно вне клеток. Это соответствовало о фазе пролиферации, что указывало на эффективность Левомеколя в переходе от воспаления к регенерации.

На 10–12 сутки пролиферативная активность достигала максимума: макрофаги и фибробласты доминировали, нейтрофилы встречались в организации ткани. Бациллярная активность не превышала 1+. Клетки единично. Фон был представлен зрелыми эпителиоцитами, которые сохраняли чёткую морфологию, без признаков дегенерации. Это отражало активную фазу репарации тканей.

Динамика снижения бактериальной обсемененности представлена на рисунке 1 (см. рисунок 1).

К 15 и 17 суткам в мазках преобладали зрелые фибробласты и эпителиальные клетки. Бактерии отсутствовали либо присутствовали в виде единичных кокков без признаков агрессии. Цитограмма отли- чалась высокой упорядоченностью: фон чистый, клетки зрелые, признаки митотической активности минимальны. Наблюдаемая структура соответствовала поздней репаративной фазе с формированием грануляционной ткани и завершением воспаления.

На протяжении всего эксперимента наблюдалась закономерная смена морфологических типов клеток от нейтрофильного преобладания к макрофагально-фибробластическому типу, что сопровождалось последовательным снижением бактериальной нагрузки. Снижение бациллярной активности по дням наглядно показано на рисунке 2 (см. рис. 2).

Полученные цитологические данные достоверно отражают фазовую динамику раневого процесса у кроликов при использовании мази «Левомеколь». На ранних сроках (3–5 сутки) преобладание нейтрофильного звена и высокая бациллярная активность свидетельствуют о выраженном воспалительном ответе, что является типичным для начальной фазы раневого процесса. В этот период отмечается активный фагоцитоз, направленный на санацию от микробной контаминации.

Появление макрофагов и фибробластов начиная с 7-х суток указывает на переход к пролиферативной фазе, при этом снижение микробной обсемененности подтверждает эффективность антибактериального компонента мази. Цитологическая картина с доминированием макрофагов и фибробластов в сочетании с упорядоченностью фона и минимальной флорой соответствует активной фазе тканевой регенерации и формированию грануляционной ткани [7].

Сравнение с литературными источниками подтверждает высокую диагностическую ценность цитологического метода в ветеринарной хирургии [9], своевременная оценка клеточного состава и микрофлоры позволяет объективно судить о фазе воспаления, риске инфицирования и эффективности лечения. В нашем исследовании наблюдаемая последовательность фаз и снижение микробной флоры коррелируют с динамикой, описанной в указанных исследованиях, что подтверждает воспроизводимость модели.

Таким образом, мазь «Левомеколь» оказывает комплексное воздействие, направленное как на купирование воспаления, так и на стимуляцию регенерации, что находит отражение в цитологической структуре мазков. При этом следует отметить, что полученные данные демонстрируют значительное снижение бактериальной нагрузки с 9,6 до 0,5 см² в течение 28 суток (см. рисунок 1). В рамках ветеринарной экспериментальной модели мы рассматриваем эти выводы как теоретически сопоставимые, без прямой экстраполяции на клиническую практику у человека.

Выводы

• 1.    Проведенное исследование позволило объективно оценить динамику репаративных и микробиологических процессов при лечении ран мазевой повязкой с препаратом Левомеколь у кроликов.

• 2.    Цитологический анализ мазков-отпечатков показал фазность воспалительно-регенеративного ответа: от преобладания нейтрофильной инфильтрации на ранних сроках до формирования зрелой грануляционной ткани с доминированием макрофагов, лимфоцитов и фибробластов к 10 суткам. Нормализация клеточного состава происходила постепенно, свидетельствуя о переходе от воспаления к репарации.

• 3.    Бактериоскопическая оценка позволила установить снижение общей микробной нагрузки и смену микрофлоры с преимущественным участием грамотрицательных палочек (Pseudomonas, Proteus) и грам-положительных кокков (Staphylococcus spp.) на ранних сроках, к их полному исчезновению или снижению до единичных бактериальных тел к 10 дню наблюдения.

• 4.    Применение индекса бациллярной активности (БАИ) позволило стандартизировать оценку антисептической эффективности терапии. Показатель БАИ снизился с 3,6 до 0,6 балла, что демонстрирует высокую эффективность препарата в отношении поверхностной микрофлоры.

• 5.    Площадь бактериальной колонизации на мазках последовательно уменьшалась с 9,5 до менее 1 см², что подтверждает достоверное снижение бактериального загрязнения под действием Левомеколя.

• 6.    Метод определения родовой принадлежности бактерий по мор-фотипу и характеру окрашивания позволил идентифицировать возбудителей на уровне родов без использования дорогостоящих молекулярных тестов и бактериологических посевов, что делает подход применимым в условиях клинической ветеринарии.

• 7.    На основании комплексного анализа цитологических, бактериологических и морфологических данных можно заключить, что Лево-меколь оказывает выраженное противовоспалительное и антисептическое действие, способствуя ускорению процессов регенерации.

• 8.    Полученные результаты могут быть использованы в ветеринарной практике как подтверждение эффективности традиционного метода лечения гнойных и поверхностных ран у мелких животных.