Доклинические испытания мясосодержащего белкового продукта

Распространенным нарушением структуры питания населения является недостаточное содержание белка животного происхождения и превышение жирового компонента в рационе по сравнению с рекомендуемыми нормами физиологических потребностей [1, 2].

Одним из объяснений этой ситуации может служить высокое содержание жирового компонента в продуктах, которые для потребителя являются традиционными источниками белка: сыры, мясные полуфабрикаты, многие сорта рыб, орехи и пр. Несмотря на высокую питательную ценность такие продукты не вполне пригодны для устранения или предупреждения дефицита белка животного происхождения в рационе многих категорий граждан, включая спортсменов и лиц с высокими физическими нагрузками.

Решением этой проблемы может служить расширение ассортимента специализированных высокобелковых продуктов, а подходящими ингредиентами, способными повысить белковый профиль продукта, являются молочные белки.

При создании новой специализированной диетической лечебной и диетической профилактической пищевой продукции для использования информации об отличительных функциональных признаках, их принято обосновывать с точки зрения доказательной медицины [3, 4]. Если же обогащенный пищевой продукт содержит нутриенты с доказанной физиологической активностью и известной суточной физиологической потребностью, эта процедура не является обязательной. Тем не менее вопросы усвояемости нутриентов и доказательства питательной ценности разработанных продуктов представляют и научный, и практический интерес.

Таблица 1 – Пищевая и энергетическая ценность продукта мясосодержащего

Массовая доля, %	Значения показателей
Белок, не менее	30,0
Жир, не более	16,0
Соль, не более	2,5

В результате технологической обработки сырья продукту придали форму паштета без введения каких-либо стабилизаторов структуры. Также продукт не содержал никаких добавленных консервантов. При этом срок годности продукта, выработанного в производственных условиях, составил 14 суток.

В работе поставлена цель – путем доклинических испытаний получить доказательные материалы в обосновании функциональных свойств мясосодержащего продукта.

Доклинические испытания с лабораторными животными выполняли в Федеральном государственном бюджетном научном учреждении «Федеральный научный центр – Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко Российской академии наук» (ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН).

Содержание и все манипуляции проводили, опираясь на Директиву 2010/63/EU Европейского парламента и совета Европейского Союза от 22 сентября 2010 года по охране животных, используемых в научных целях [7].

Математическую обработку экспериментальных данных проводили по результатам опытов в 3‒5-кратной повторности с помощью методов статистики и регрессионного анализа с использованием персонального компьютера и пакета программного обеспечения «Microsoft Excel», «Statistiсa». Достоверность полученных результатов оценивали с помощью критерия Стъюдента, полученные регрессионные зависимости проверяли на адекватность экспериментальным данным по критерию Фишера [8].

В исследовании объектом наблюдений были 20 белых растущих мышей-самцов (виварий БУВВО «Вологодская облветлаборатория», Россия). В питомнике животные получали общевиварный рацион, содержащий смесь злаков (овес, геркулесовые хлопья, просо, белый хлеб в произвольном соотношении) и свежих овощей (морковь, капуста).

После подготовительного периода мышей ввели в эксперимент, который проводили совместно с сотрудниками ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН.

В течение всего периода эксперимента лабораторные животные обеих групп находились в сухой светлой комнате. Температура воздуха в помещении составляла (20±3) °С, влажность воздуха – (48±2) %, освещение – режим день/ночь с 6:00 до 17:00.

Мышей содержали в проветриваемых контейнерах из пластика с закрепленными автоматическими поилками и кормушками. Размер контейнеров составлял 300×400×260 мм. В качестве подстилки использовали крупные древесные опилки. Помимо ежедневной уборки клеток, еженедельно проводили их дезинфекцию этанолом (70 %). На время дезинфекции животных помещали в чистые запасные клетки.

Экспериментальные исследования включали два периода: адаптационный и основной. Длительность адаптационного периода составляла семь дней, основного – 10 дней. С периодичностью один раз в два дня проводили взвешивание всех животных. Среднее значение массы тела животных по группе устанавливали путем обработки полученных данных с применением Методического руководства «Биометрическая обработка лабораторных, клинических и эпизоотологических данных» [9].

Все манипуляции проводили в соответствии с Приказом Минздрава России от 01.04.2016 № 199н «Об утверждении Правил надлежащей лабораторной практики» (зарегистр. в Минюсте России 15.08.2016 № 43232) [10].

Доступ животных к корму и воде был свободным. Корма выдавали из расчета 10 г на одно животное.

В период адаптации мыши обеих групп получали комбикорма, включающие мультизерновые гранулы (соя, пшеница, овес, подсолнечник, лен, дрожжи), сушеный банан и гранулы, обогащенные кормовыми добавками, витаминами и минеральными веществами. Пищевая и энергетическая ценность кормов представлена в таблице 2 .

Таблица 2 – Пищевая и энергетическая ценность рационов

Рацион	Содержание, г белка   жира		в 100 г углеводов	Энергетическая ценность/ калорийность
Общевиварный	3,5-3,7	1,2-1,4	12,0-13,0	73-83
Комбикорма	12,0-16,0	4,1-5,0	64,0-69,0	340-360

Через семь дней адаптационного периода лабораторные животные были произвольно поделены на две группы: опытная (n = 10) и контрольная (n = 10).

В основной период животные контрольной группы продолжали получать комбикорма, а животные опытной группы дополнительно к привычному корму стали получать мясосодержащий белковый продукт. При этом соотношение макронутриентов и энергетическая ценность рациона оставались такими же, как в как в контрольной группе.

В последний день каждого периода эксперимента у всех животных брали кровь из сердца. Биохимическое исследование сыворотки крови проводили в БУВВО «Вологодская облветлаборатория».

Исходные средние показатели массы тела были равны (17,81±0,82) г в опытной группе и (16,38±1,02) г – в контрольной ( рис. 1 ).

Рисунок 1 — Изменение массы тела лабораторных животных

В течение всего периода наблюдений (17 дней) животные в опытной группе были более активны по сравнению с контролем, хорошо поедали корм. Шерстный покров у мышей в опыте был чистый, гладкий, блестящий, что говорит о хорошем усвоении белкового продукта.

Биохимические анализы крови показали, что содержание общего белка в крови животных контрольной группы не изменилось на протяжении всего основного периода и составило 57 г/л. В крови животных опытной группы наблюдали увеличение содержания общего белка с 45 г/л в начале опытного периода и до 50 г/л – в конце ( рис. 2 ), что в относительном выражении составило 11,1 %. Это может указывать на усвоение белка мясосодержащего продукта.

Рисунок 2 — Содержание общего белка в крови лабораторных животных , г/л

Коррелируют с повышением содержания общего белка и другие показатели крови лабораторных животных.

Как известно, образование мочевины в здоровом организме зависит от характера питания, и с повышением белковой составляющей рациона концентрация мочевины может повышаться [11].

На фоне увеличения содержания белка в комбикормах по сравнению с общевиварным рационом в крови животных обеих групп произошло достоверное увеличение содержания мочевины ( рис. 3 ).

У животных контрольной группы количество мочевины крови возросло с 12,68 мг% в начале опытного периода до 16,55 мг% в конце, у животных опытной группы, соответственно, – с 17,14 до 34,46 мг%. В относительном выражении увеличение этого показателя составило треть в контрольной группе и 101,1 % – в опытной, что также указывает на усвоение белка из мясосодержащего продукта животными опытной группы.

Рисунок 3 — Увеличение содержания мочевины в крови лабораторных животных , мг%

Позитивно в данном случае можно трактовать и снижение активности клеточных ферментов: аланинаминотрансферазы (АЛТ) и аспартатаминотрансферазы (АСТ).

Количество АЛТ в крови животных контрольной группы понизилось с 55 до 32 ед/л, а в крови животных опытной группы ‒ с 52 до 38 ед/л. Количество АСТ в крови животных контрольной группы понизилось с 261 до 118 ед/л, а в крови животных опытной группы ‒ с 192 до 153 ед/л. Хотя в доступной литературе не найдено референсных значений активности этих ферментов для мышей, снижение активности АЛТ и АСТ свидетельствует об отсутствии повреждений печени животных. Так можно утверждать потому, что к повышению уровня трансаминаз в крови приводит увеличение скорости обновления ферментов на фоне повреждения клеток печени [12].

Также в крови животных обеих групп достоверно возросло содержание креатинина ( рис. 4 ).

На рисунке видно, что при начальном содержании креатинина в крови контрольных мышей 6,44 ммоль/л, а в крови опытных животных 5,63 ммоль/л, к концу опытного периода, показатели сравнялись и достигали 23,5 ммоль/л. В относительном выражении увеличение содержания креатинина составило 365 % в контрольной группе и 417 % – в опытной. Это также может свидетельствовать о лучшем усвоении белка корма животными опытной группы и об увеличении объема мышечной массы.

Следует подчеркнуть, что в нашем случае это первая попытка проведения доклинических испытаний нового пищевого продукта. Несмо- тря на то, что дизайн эксперимента имеет некоторые недостатки, приобретенный опыт позволит учесть их при проведении доклинических испытаний пищевых продуктов в дальнейшем.

Рисунок 4 — Содержание креатинина в крови лабораторных животных , ммоль/л

По совокупности полученных данных: прирост массы тела, улучшение ряда биохимических показателей крови и общего состояния лабораторных животных ‒ можно утверждать о хорошем усвоении разработанного мясосодержащего продукта.