Физиолого-биохимическая характеристика аэробных органотрофных бактерий, выделенных из щелочных гидротерм Байкальского региона

В щелочных термальных источниках Байкальского региона развиваются специфические сообщества алкалотермофильных микроорганизмов, которые активно участвуют в процессах деструкции органического вещества гидрогерм.

Из проб донных осадков и микробных матов гидротерм Хужирт, Шиверт, Цэнхэр (Монголия) и Уро, Большая речка, Алла, Сея, Гусиха и Гарга (Бурятия) с различным температурным режимом (37-84ОС) и pH 8,0-10,6 было выделено 22 штамма термофильных бактерий. Для выделения аэробных органотрофов были использованы модифицированные минеральные среды, содержащие в качестве субстратов глюкозу, пептон или крахмал. Пробы инкубировали при температуре 55°С, pH 8,0-9,5. Идентификация выделенных микроорганизмов была проведена на основе морфологических, физиолого-биохимических и молекулярных признаков. Морфологически бактерии были представлены разных размеров палочками, образующими терминальные споры. Все штаммы являются алкалотолерантными умеренными термофилами с оптиму-мами роста при 50-60°С. Молекулярный анализ с использованием генов 16S рРНК выделенных культур показал, что выделенные бактерии представлены родами Bacillus, Anoxibacillus sp.

Bacillus hemicellulosolyticwn выделен из термального источника Уро, Т 69,гС, pH 8,7-9,0, Северное Прибайкалье. Клетки представляют собой неподвижные, спорообразующие палочки. Грамположительного типа. Колонии гладкие дисковидные, около 3 мм в диаметре, белого цвета. Факультативный анаэроб. Умеренный термофил, растущий при 37-72°С, с оптимумом 604'. Алкалотолерантен, растет при pH 6,0-9,5 с оптимумом 8,5. Растет при концентрациях NaCI от 0 до 50 г/л, оптимум 2-5 г/л.

. Маннит, фруктоза, дульцит, сахароза, мальтоза, манноза, глицерин, целлюлоза и дрожжевой экстракт поддерживают рост. Арабиноза, инозит, сорбит, раффиноза, глюкоза, лактоза и галактоза не используются. Способен к брожению на сахарозе.

Сходство по 16рРНК составляет 99%.

Bacillus licheniformis выделен из горячего источника Большая речка, расположенного на побережье оз. Байкал. Т 61,4°С, pH 9,2-9,8.Клетки представляют собой неподвижные спорообразующие палочки. Колонии неровные, размером 3-4 мм. Факультативный анаэроб. Умеренный термофил, оптимальная температура роста 55°С. Алкалотолерантен с оптимумом pH 8,0.

Гетеротроф. Использует арабинозу, манит, инозит, сорбит, рамнозу, фруктозу, дульцит, раффинозу, глюкозу, сахарозу, мальтозу, лактозу, галактозу, маннозу, глицерин и дрожжевой экстракт. Способен к брожению на глюкозе и сахарозе.Тесты на каталазу и оксидазу положительные; не продуцировал аммиак, индол и сероводород. На безазотистой среде Эшби роста не проявлял.

По результатам частичного сиквенса I6S рРНК штамм отнесен к виду Bacillus licheni/ormis (97%).

Anoxybacillus 5р.выделен из гидротермального источника Гарга, Северное Прибайкалье. Т 72,5°С, pH 8,2. .

Клетки представляют собой неподвижные палочки мкм. Колонии гладкие, белые, диаметром 3-5 мм. Факультативный анаэроб. Умеренный термофил: диапазон роста 40-75°С, оптимум 60°С. pH диапазон 6,5-9,0, оптимум 8,0. Способен расти при концентрациях NaCl от 0 до 50 г/л, оптимум 2-5 г/л.

Гетеротроф. Арабиноза, манит, инозит, сорбит, рамноза, фруктоза, дульцит, раффиноза, глюкоза, сахароза, мальтоза, лактоза, галактоза, манноза, глицерин и дрожжевой экстракт поддерживают рост. Способен к брожению на глюкозе и сахарозе.

По результатам неполного сиквенса нуклеотидной последовательности гена165 рРНК штамм был отнесен к виду Anoxybacillus sp.,A. bogroviensis, A. Jlavithermus (100%).

Клетки представляют собой спорообразующие палочки. Растет при температурах от 30 до 65°С, с оптимумом 50°С. pH диапазон 6,5-10,0, оптимум 8,5. Факультативный ана-эроб.Гетеротроф, рост поддерживается различными сахарами и полисахаридами, петоном и дрожжевым экстрактом.

Ближайшим родственником является Anoxybacillus pushinoensis, сходство по 16S рРНК составляет 95%. Типовой штамм Се-1^Т.

Также выделено и изучено 8 штаммов алакалотолерантных термофильных органотрофных факультативно анаэробных бактерий из донных отложений и микробных матов термальных источников Прибайкалья: Сея, Уро, Алла, Гусиха, Гарга, Большая речка.

Все штаммы являются умеренными термофилами с диапазоном роста от 37 до 75°С и оптимумом 45-60°С. Диапазон pH от 6,0 до 9,5, оптимум pH 8,0-8,5. Оптимальной концентрацией NaCl (г/л) для роста культур являлась 2-5 г/л, диапазон роста от 0 до 50 г/л.

Культуры обладали широкой метаболической активностью и использовали большинство протестированных субстратов: арабинозу, галактозу, глюкозу, маннит, фруктозу, раффинозу, сахарозу, мальтозу, маннозу, дульцит, инозит, пептон, дрожжевой экстракт, крахмал и глицерин. Рамноза, лактоза и сорбит не использовались. Организмы способны к брожению на глюкозе и сахарозе, не сбраживали лактат, рамнозу, пептон, дрожжевой экстракт, крахмал и целлюлозу. Тесты на каталазу и оксидазу положительные; не продуцировали аммиак, индол и сероводород. На безазотистой среде Эшби роста не проявляли.

Все выделенные штаммы были протестированы на наличие потенциальной ферментативной активности, а именно: протеазной, липазной и амилазной. Все культуры проявили высокую протеазную активность (активно разжижали желатиновые диски) при 55°С. Липазную активность определяли при температуре 55°С. Всего 8 организмов показали способность расщеплять субстрат твин-40. При этом диаметр зон омыления варьировал от 6 до 15 мм. Высокую активность проявили бактерии по расщеплению крахмального агара, суммарно 9 из 12 штаммов показали различные зоны просветления (от 5 до И мм). Таким образом, можно заключить, что большинство штаммов термофильных бактерий проявило потенциальную протеазную, липазную и амилазную акивности. По физиолого-биохимическим свойствам штаммы близки к видам Bacillus, Anoxybacillus.

Anoxybacillus mongoliensis Из проб ила низкоминерализованных щелочных гидротерм Центральной Монголии Хужирт (Huzhirt), Шиверт (Shivert) и Цэнхэр (Tsenher) с температурами 37-84°С и значениями pH 9,8-10,6 было выделено 10 штаммов аэробных термофильных бактерий. Пробы культивировались при 55°С на минеральной среде содержащей глюкозу (19 г/л) и цитрат натрия (1,29 г/л), без перемешивания. Чистые культуры были получены путем высева суспензии микроорганизмов на агар и последующих пересевов.

На поверхности агаризованной среды бактерии формировали округлые колонии диаметром 2-4 мм, кремовые, имеющие выпуклый профиль, ровные края и однородную структуру. Клетки имели форму прямых палочек, как правило одиночных или в парах. В конце фазы замедленного роста наблюдали появление проспор, спорулирующих клеток и отдельно лежащих спор. Образующиеся эллипсоидальные споры располагались в материнской клетке терминально, несколько расширяя ее. Клетки имели размеры 2-2,3 х 9,3-16,6 мкм. Окраска по Граму положительная.

Все штаммы являются термофилами с диапазоном роста от 37 до 75°С и оптимумом 58-61°С (рис.З). Диапазон pH от 6,0 до 10,5, оптимум pH 7,0-8,5 Оптимальной концентрацией NaCI (г/л) для роста культур являлась 2-5 г/л, диапазон роста от 0 до 50 г/л.

Бактерии способны в аэробных условиях утилизировать широкий спектр органических соединений: арабинозу, ксилозу, рибозу, глюкозу, маннит, фруктозу, рамнозу, раффинозу, сахарозу, инозит, глутамат, лактат, пируват, ацетат, пептон, дрожжевой экстракт, гидролизат казеина, крахмал и углеводороды. Галактоза, дульцит, манноза, сорбит, лактоза, мальтоза, глицерин и гликолят не использовались. Организм способен к брожению на глюкозе и сахарозе, не сбраживали глутамат, лактат, пируват, рибозу, рамнозу, пептон, дрожжевой экстракт, гидролизат казеина, крахмал и целлюлозу. Тесты на каталазу и оксидазу положительные; не продуцировали аммиак, индол.

Анаэробный рост проверяли на среде со след, субстратами: глутаматом, лактатом, пируватом, рибозой, глюкозой, сахарозой, рамнозой, пептоном, д/э, гидролизатом казеина, крахмалом и целлюлозой по 1 г/л. За счет брожения могут развиваться штаммы Н5, Т4 на глюкозе, сахарозе (3-х суточные).

Молекулярный анализ с использованием генов 16S рРНК выделенных культур показал, что выделенные штаммы Н5, S3, Т4 и Т5 относятся к роду Anoxibacillus и наиболее близки к А. jlavithermus (97, 97,97 и 96 % соответственно). Содержание ГЦ составило от 43,8 до 44,6 мол. %, что близко к соответствующим значениям для видов рода Anoxybacillus. Гомология ДНК выделенных штаммов между собой составила 95-99 мол. %. Уровень геномного сходства штаммов Н5 и Т4 с типовыми штаммами A. Jlavithermus DSM 2641^Т и A. pushchinensis К1 Находится в диапазоне от 28 до 47 %, что свидетельствует о родстве исследованных организмов на уровне рода, но недостаточен для отнесения штаммов Н5 и Т4 к ранее описанным видам рода Anoxybacillus. Таким образом, выделенные штаммы по совокупности свойств (размер клеток, окраска колоний, способность к использованию галактозы и мальтозы, способность к росту при более высоких температурах и низкий уровень гомологии ДНК) могут быть отнесены к роду Anoxybacillus и образуют в его составе новый вид Anoxybacillus mongoliensis

Таким образом, показано, что среди культивируемых видов, выделенных из щелочных гидротерм Бурятии и Монголии, преобладают как широко распространенные термофильные алка-лотолерантные бациллы, так и новые виды аэробных и факультативно-анаэробных алкалото-лерантных умеренно термофильных бактерий, способных использовать широкий спектр органических субстратов.

Работа была выполнена при финансовой поддержке проекта молодых ученых СО РАН «Разнообразие и функционирование микробного сообщества в щелочных водных экосистемах Забайкалья» и интеграционного проекта СО РАН №24.

О.Ф. Вятчина, Д. И. Стом, О.С Рыкова, В. А. Быбин, А.В. Кононова г. Иркутск

Возможность сохранения некоторых групп микроорганизмов в кишечнике красного калифорнийского гибрида (Eisenia fetida Andrei Войске)*

The ability of different groups of microorganisms to survive and keep itself in intestines of Red Californian hybrid (Eis-enia fetida Andrei Bouche) is investigated. It is shown, that oil-destroing strain of Yarrowia lipolytica is capable to keep itself in intestines of earthworm during 8 days, and Rhodococcus erythropolis only within a day. Bacillus thuringiensis collects in intestines of earthworms, becomes a dominating component of bacterial auto flora, keeps toxin formation ability; don "t bring harm to an animal It is revealed, that Streptomyces sp. spores keep ability to germinate after passage through the intestinal puth of a worm. Staphylococcus sp. strain is capable to reserve itself in intestines of a worm untill 2 months.

Исследована способность микроорганизмов разных групп выживать и сохраняться в кишечнике красного калифорнийского гибрида (Eisenia fetida Andrei Bouche). Показано, что нефтеразрушающий штамм Yarrowia lipolytica способен сохраняться в кишечнике червя в течение 8