Аэробные метилобактерии прибрежных гидротерм озера Байкал (Республика Бурятия)

Аэробные метилобактерии, усваивающие биогенные и антропогенные С 1 -субстраты, широко распространены в природе. В водных экосистемах аэробные метилобактерии играют существенную роль в круговороте биогенных элементов. К настоящему времени наиболее полно исследованы аэробные метилобактерии в морских экосистемах, в водоемах, имеющих высокие значения pH и солености, а также в корнях и коре растений [1-4]. Однако имеется весьма ограниченная информация об аэробных метилобактериях экстремальных экосистем, включая гидротермальные источники. Целью данного исследования является выделение и идентификация аэробных метилобактерий в грунтах прибрежных гидротерм озера Байкал.

Объекты и методы исследования

Объектами исследования были пробы грунтов из гидротерм Змеиный, Горячинск и Сухая, выходы которых расположены в прибрежной зоне восточного побережья озера Байкал. Температура воды на изли-вах гидротерм Змеиный и Сухая составляла 45оС, в источнике Горячинск 51оС. Источники относятся к низкоминерализованным гидротермам (0,5-0,6 г/дм3) со слабощелочным значением pH (8,4-9,4).

Для получения накопительных культур аэробных метилобактерий использовали среду «М» с добавлением 0,2-0,5% NaCl, содержащую (г/л): КН 2 РО 4 – 1,0; KNO 3 – 1,0; MgSO 4 ∙7H 2 O – 0,2 и 1 мл/л раствора микроэлементов (мг): FeNH 4 -цитрат – 300; CaCl 2 ∙2H 2 O – 300; MnCl 2 ∙4H 2 O – 50; ZnSO 4 ∙7H 2 O – 50; CuSO 4 ∙5H 2 O – 5; Н 2 О – 100 мл. Соответствующие природному образцу значения pH устанавливали, добавляя Na-карбонатный буфер в конечной концентрации 50-100 мМ. После стерилизации в среды вносили 0.5% (об./об.) метанола как источник углерода и 0,05% (об./об.) дрожжевого автолизата в качестве источника витаминов. Культивирование проводили при температурах 29, 37 и 45^оС.

Выделение ДНК из культур и ПЦР-амплификацию проводили известными методами [5, 6]. Нуклеотидные последовательности ПЦР-продуктов определяли на автоматическом секвенаторе CEQ 2000XL Beckman Coulter (США) с использованием набора BigDye Terminator Cycle Sequencing kit («Perkin Elmer», США) согласно инструкциям фирмы-производителя. Для сравнения нуклеотидных и транслированных аминокислотных последовательностей фрагментов гена 16S рРНК (1500 п.н.) с таковыми в GenBank использовали программу NCBI BLAST (http//, для вы-равнивания– программу Clustal W (версия 1.3). Филогенетическое дерево было построено с использованием программы Treecon W (версия 1.3).

Результаты и их обсуждение

Из проб грунтов исследуемых источников нами было выделено 6 штаммов аэробных факультативных метилобактерий. 5 штаммов представлены грамположительными подвижными спорообразующими палочками (табл.1).

Характеристика выделенных штаммов аэробных метилобактерий

Таблица 1

Штамм	Гидротерма	Спорообразование	Подвижность	Окраска по Граму
C2	Сухая	+	+	+
Z1	Змеиный	+	+	+
Z3	Змеиный	+	+	+
G1	Горячинск	+	+	+
G4b	Горячинск	+	+	+
G6	Горячинск	-	+	+

Исследование экофизиологии культур метилобактерий, выделенных из гидротерм, показало, что они способны развиваться в диапазоне температур от 29 до 37оС. Все штаммы являются мезофилами (рис.1). Культуры изолированы из гидротерм со слабощелочной реакцией среды. Рост наблюдался в широком диапазоне значений pH – от 6,0 до 10, наиболее активный рост был отмечен при рН 7,5-9,0. Штаммы C2, Z1 и G1 являются алкалофильными мезофилами, штаммы Z3, G4b, G6 – нейтрофильными мезофилами. По отношению к минерализации среды выделенные культуры проявили наибольший рост на среде, содержащей 2 г/л. У культур – G1 и Z1 оптимум солености проявился при 2 и 5 г/л, соответственно. Все культуры растут в диапазоне содержания NaCl от 0 до 50 г/л.

ToC

♦ C2

Z1

Z3

G1

G4b

—•— G6

Рис .1. Зависимость интенсивности роста культур метилобактерий от температуры, pH и NaCl.

Культуры использовали широкий спектр субстратов , представленный следующими группами :

• 1)    пентозы : арабиноза;

• 2)    гексозы : галактоза, глюкоза, манноза, фруктоза;

• 3)    дезоксигексозы : рамноза;

• 4)    олигосахариды : лактоза, мальтоза, раффиноза, сахароза;

• 5)    спирты : глицерин, маннит, дульцит, сорбит, этанол;

• 6)    витамины : инозит.

0.1

Все штаммы способны утилизировать многие органические соединения, наиболее активно использовались углеводы группы гексоз . Из группы олигосахаридов наиболее потребляемыми являются сахароза и мальтоза по сравнению с лактозой и рафинозой. Большинство культур использует для роста глюкозу, маннозу, фруктозу, мальтозу, сахарозу. Рост отсутствовал на дульците, саркозине и глицерине .

I-------------------------------------------------------------------------1

94 г Штамм Z1

W— Штамм Z3

I Bacillus cohnii

— Bacillus halmapalus DSM8723

6$   --- Bacillus Horikoshi DSM8719

Bacillus halodurans XJU2 100

Bacillus halodurans

10( Штамм G1

Штамм C2

Bacillus methanolis

Bacillus firmus S-26

Штамм G4b

Bacillus pseudofirmus DSM8715

100, - Штамм G6

^L Exiguobacterium aurantiacum DSM6703

Рис .2. Филогенетическое дерево, построенное на основании нуклеотидных последовательностей фрагментов гена 16S рРНК

Филогенетический анализ гена 16S рРНК выделенных штаммов показал, что штаммы Z1 и Z3 наиболее близки к Bacillus cohnii (94 и 100% сходства соответственно), штаммы G1 и C5 близки к Bacillus halodurans (100% сходства) (рис.2). Ранее была отмечена способность представителей рода Bacillus к ме-тилотрофии, описан и исследован термотолерантный метилотрофный вид Bacillus methanolicus [7].

Один штамм G6 наиболее близок к Exiguobacterium aurantiacum (100% сходства). Нужно отметить, что ранее не был отмечен рост Exiguobacterium aurantiacum на метаноле и нами впервые установлена способность данного вида к метилотрофии.

Таким образом, выделенные из грунтов гидротерм Бурятии метилобактерии представлены алка-лофильными и нейтрофильными мезофилами и в основном принадлежат к роду Bacillus . Они являются факультативными метилобактериями, использующими широкий спектр субстратов.