Люминесцентные свойства размолотого фуражного зерна при варьировании содержания жиров

Введение. Цифровые технологии активно разрабатываются и внедряются в сельском хозяйстве, в том числе для повышения эффективности кормопроизводства и животноводства [1]. Одним из направлений увеличения объема и повышения качества животноводческой продукции является контроль питательной ценности кормов [2]. Он необходим для оптимизации рационов, повышения продуктивности животных и их здоровья. Низкая питательная ценность основных кормов вызывает необходимость в балансировке рационов за счет добавления концентрированных кормов, что экономически невыгодно, а излишнее добавление концентратов ведет к различным нарушениям в обмене веществ [3]. Высокая продуктивность животных тесно связывается с прочной кормовой базой, которая обеспечивает животных полноценными рационами, содержащими необходимый набор питательных веществ [4].

Фуражное зерно широко используется в кормлении сельскохозяйственных животных – птицы и скота и занимает значительную долю в кормлении – 20–80 %, в зависимости от вида животного. Оно обладает высокими питательными свойствами и содержит в себе необходимые микро- и макроэлементы, необходимые для полноценного развития и поддержания жизнедеятельности животных [5], а включение зерновых в состав комбикормов с целью балансировки по основным компонентам кормления на сегодняшний день является одной из главных возможностей повышения продуктивности жи- вотных одновременно с сокращением расхода кормов [6].

Применение цельного зерна пшеницы, ячменя и овса вместо части комбикорма для кур способствует высоким зоотехническим показателям при выращивании молодняка и содержании взрослых птиц, при этом лучшая продуктивность отмечена при скармливании овса и пшеницы [7]. Зерновые культуры являются важным компонентом рациона жвачных животных. За счет содержания в них крахмала, который обеспечивает высокую плотность энергии, включение в рацион крупного рогатого скота зерновых культур поддерживает высокую производительность молока и быстрые темпы роста животного [8].

Содержание жира – ключевой показатель питательной ценности кормов. Жиры располагаются на мембранных структурах клеток, и занимают важное место среди энергетических веществ и являются обязательным элементом кормового рациона и одним из важнейших источников энергии. Они участвуют в процессах регулирования обмена веществ, сохранения энергии, переноса витаминов, гормонов, а также являются источниками незаменимых жирных кислот [9], основой для последующего синтеза биологически активных веществ, могут улучшать физические свойства и вкусовые качества корма [10]. Недостаточное или же, наоборот, избыточное количество жиров может вызывать негативные последствия для живых организмов.

Улучшение кормового рациона и использование дополнительных кормов способствуют повышению продуктивности коз [11]. Добавление масла в корм генетически улучшенных бройлеров необходимо для удовлетворения энергетических потребностей, а также для улучшения метаболизма, показателей роста [12] и иммунного ответа [13]. Корма с растительными маслами потенциально могут быть интегрированы в практику аквакультуры [14], что позволит решить проблему удовлетворения потребности рыб в питательных веществах [15].

Обеспечение коров более полноценным и сбалансированным рационом может повысить их устойчивость к болезням и снизить их заболеваемость. Изучение свойств кормов, в том числе определение содержания жиров, также способствуют формированию теоретической базы для составления рациона для крупного рогатого скота [16], разработке новых кормов из некоторых видов биомассы [17].

Традиционными методами определения жира в кормах являются методы «мокрой химии». Достаточно часто применяется экстракционногравиметрический метод Сокслета [18, 19], где навеску хорошо измельчают и помещают в бумажный патрон, прикрывая ватой, после чего патрон помещают в экстрактор, где в колбе кипятят эфир, пары которого преодолевают холодильник, и уже жидкий эфир попадает в патрон, эфир при этом извлекает жир и впоследствии удаляется испарением [20]. При массовых анализах применяется метод Рушковского, основанный на определении сырого жира по количеству обезжиренного остатка и позволяющий проводить исследования одновременно нескольких видов кормов в экстракторе аппарата Сокслета или Еременко [21].

Для экстракции и контроля содержания жира также применяются: метод микроволновой экстракции, заключающийся в воздействии на продукты микроволновым излучением, под воздействием которого фракция разделяется на липиды и растворитель; метод сверхкритической флюидной экстракции, основывающийся на том, что образец подвергается небольшому нагреванию в камере под давлением, после чего смешивают со сверхкритической жидкостью CO 2 , который извлекает липидную фракцию и удаляется; метод ультразвуковой экстракции, где измельченный образец помещают в колбу и смешивают с растворителем, после чего колбу помещают в ультразвуковую ванну для выделения липидной фракции [22].

Альтернативой описанным методам анализа являются методы, основанные на взаимодействии образца с оптическим излучением, – оптические спектральные: флуоресцентная спектроскопия (измерение спектров флуоресценции), рамановская (измерение спектров комбинационного рассеяния), абсорбционная (измерение спектров поглощения), отражательная (измерение спектров отражения излучения от образца) и неспектральные: рефрактометрия (исследование распространения излучения в среде), поляриметрия (исследование параметров поляризации излучения), рефлектометрия (исследование френелевского отражения), методы анализа кормов. Эти методы селективные, прецизионные, дистанционные, неразрушающие, экспрессные, не требуют расходных материалов и наличия высококвалифицированных специалистов. Распространены методы инфракрасной спектроскопии в спектральном диапазоне 800– 1200 нм [23], использующие для измерения массовой доли жира характерную полосу поглощения углерод-водородных связей [24]. Примерами таких коммерческих лабораторных и переносных приборов являются FOSS NIRS DS2500 (Дания), ИнфраЛЮМ (Россия), X-NIR (Италия) и многие другие. Недостатки многих таких приборов заключаются в сравнительно больших массогабаритных показателях (даже у переносных, таких как X-NIR) и высокой стоимости. В связи с этим становится важным создание сравнительно недорогого компактного анализатора кормов, способного экспрессно измерять большинство их параметров качества. Такой прибор может быть разработан на основе оптического фотолюминесцентного метода.

Цель исследования – определение информативных параметров фотолюминесценции фуражного зерна пшеницы, овса и ячменя для контроля содержания в них жиров.

Задачи: выявить наиболее информативные спектры люминесценции зерна, провести расчет потоков люминесценции, определить влияние варьирования жира образцов на поток люминесценции.

Объекты и методы. Для исследований были использованы образцы фуражного зерна пшеницы, овса и ячменя. Образцы были размолоты с помощью измельчителя ЛЗМ-1м в течение одной минуты до среднего размера помола не более 2,5 мм согласно условиям ГОСТ 8770-Комбикорм. Величину модуля помола находили методом ситового анализа на эталонных ситах с диаметрами отверстий 0,45 мм, 0,7, 1, 1,6, 2,4, 2,8 мм. Определение концентрации жира CF в образцах осуществляли на приборе FOSS NIRS DS2500. Содержание жира изменяли путем мелкодисперсного распыления растительного масла в исследуемый размол с параллельным контролем массы на аналитических весах и последующей герметизацией образца на одни сутки.

Спектры возбуждения (эффективного поглощения) и фотолюминесценции измеряли дифракционным спектрофлуориметром СМ2203 (SOLAR, Белоруссия) с внешней светозащитной камерой по методике [25]. Спектрофлуориметр включает оптическую систему с импульсной ксеноновой лампой в качестве источника излучения и фотоэлектронным умножителем в качестве приемника излучения. Лампа работает в режиме коротких импульсов длительностью 1,5 мкс и частотой 25 Гц. Для выделения необходимого спектрального диапазона использовался монохроматор с вогнутой дифракционной решеткой, работающий в первом порядке дифракции. На начальном этапе проводили синхронное сканирование монохроматорами для получения спектров возбуждения η(λ) для расширенного интервала длин волн от 230 до 600 нм. На следующем этапе находили наиболее значимые пики возбуждения λ в . Установив монохроматор возбуждения на длины волн λ в , проводили сканирование спектров фотолюми-несцентного излучения φ(λ). Шаг сканирования спектров составлял 2 нм, чувствительность фотоэлектронного умножителя – средняя. Полученные характеристики обработали на инструментальные искажения с помощью программного обеспечения «Microcal Origin». Повторность спектральных измерений для каждого исследуемого образца – двадцатикратная. По результатам спектральных измерений рассчитали интегральные параметры, являющиеся относительными потоками фотолюминесценции Φ λ для каждой длины волны λ в . В программе Microcal Origin были рассчитаны статистические параметры спектров: математическое ожидание, дисперсия, асимметрия, эксцесса.

Математическое ожидание M λ (в нанометрах) для непрерывного спектрального распределения определяется интегрированием по плотности распределения

M l = ^Л П(ЛМ       (1)

где λ 1 , λ 2 – наименьшее и наибольшее значение длин волн спектра возбуждения (поглощения).

Дисперсия σ2 как статистический показатель, который характеризует разброс значений в выборке или совокупности, находится по формуле а 2 =f^ -MJ2 ф(*) Л    (2)

Числовой характеристикой асимметричности является центральный статический момент 3-го порядка μ 3

М з = ^(* -MJ ³ ф ( * ) d*.      (3)

Более распространенным параметром оценки асимметричности спектрального распределения является асимметрия As, определяемая из соотношения

As = — г.             (4)

σ3

Асимметрия может быть правосторонней ( As > 0) либо левосторонней ( As <0).

Числовой характеристикой крутизны спектра служит оценка центрального статического момента 4-го порядка μ 4

• _М4 = 0* -MJ * ф ( * ) d*.     (5)

Для анализа крутизны используют эксцесс Eλ eх = —4- - 3.             (6)

σ

Результаты и их обсуждение. В качестве примера на рисунке 1 представлены спектры поглощения η(λ) при синхронном сканировании размолов пшеницы разной жирности.

Рис. 1. Спектры поглощения фуражного зерна пшеницы с различным содержанием жиров Absorption spectra of feed grain of wheat with different fat content

Спектры возбуждения (поглощения) находятся в диапазоне 230–450нм. Для размолов пшеницы характеристики η(λ) содержат наибольшие максимумы на длинах волн около 290 и 362 нм и сравнительно небольшой максимум примерно на 414 нм. С ростом концентрации жира характеристики смещаются вниз, т. е. уменьшаются поглощательная и, как следствие, излучательная способности. Это может быть вызвано концентрационным тушением люминесценции.

Для размолов овса и ячменя в спектрах поглощения содержатся максимумы на длинах волн 282 нм, 362 и 424 нм. Два более длинно- волновых максимума характерны для целых неразмолотых зерен [26]. Наличие поглощения на 362 нм связывают с фенольной кислотой. Более длинноволновое поглощение (λв = 424 нм) может быть вызвано наличием рибофлавина, каротиноидов, а также суперпозицией спектров излучения терпеноидов, спорополленина, липофусцина [27].

Для оценки качественных изменений спектров поглощения размолов зерна пшеницы, овса и ячменя рассчитали статистические параметры и представили их в таблице 1.

Таблица 1

Статистические параметры размолов пшеницы, овса и ячменя при варьировании жирности Statistical parameters of wheat, oat and barley grindings with varying fat content

C F , %	M λ , нм	σ²	As	Ex
1	2	3	4	5
Пшеница
1,5	332	3182	0,596	0,350
6,7	338	2923	0,533	0,467
9,4	339	2794	0,477	0,379
12,3	337	2704	0,455	0,321
15,5	336	2574	0,488	0,334
17,5	343	2507	0,367	0,316

Окончание табл. 1

1	2	3	4	5
Овес
4,08	344	4498	0,522	-0,240
5,66	351	4645	0,371	-0,444
7,05	349	4359	0,447	-0,227
8,96	355	4326	0,325	-0,283
10,50	358	4382	0,336	-0,149
12,80	362	3945	0,280	0,029
14,36	358	3927	0,271	-0,117
17,40	361	3929	0,276	-0,070
Ячмень
1,89	356	3977	0,379	-0,019
4,56	357	3663	0,374	0,142
7,36	358	3543	0,397	0,166
9,16	364	3432	0,364	0,228
11,60	362	3193	0,417	0,355
13,10	366	3347	0,377	0,253
15,28	367	3079	0,361	0,379
17,14	373	3057	0,289	0,464

Из данных таблицы 1 видно, что при увеличении содержания жира математическое ожидание для всех исследованных видов размолов зерна увеличивается, но статистически достоверную линейную аппроксимацию можно получить только для ячменя (коэффициент детерминации R ² = 0,89) и в меньшей степени для овса ( R ² = 0,80). Увеличение M λ незначительное и составляет менее 5 % при увеличении жирности в 4–12 раз. Величина дисперсии σ² уменьшается с увеличением концентрации жира, причем коэффициент детерминации высок для пшеницы ( R ² = 0,99) и ячменя ( R ² = 0,93), но само изменение дисперсии тоже не столь велико – не более 23 %.

Все характеристики η(λ) для всех видов зерна имеют правостороннюю асимметрию ( As > 0), которая с ростом C F уменьшается также несистемно и незначительно. Величина эксцесса для каждого вида зерна меняется по-разному. Для пшеницы спектры поглощения имеют ярко выраженную островершинность, и с ростом жирности эксцесс несистемно уменьшается. Для овса спектры плосковершинные, но модуль эксцесса также несистемно уменьшается. Для овса с ростом C F идет линейно аппроксимируемое ( R ² = 0,91) увеличение эксцесса с переходом от плосковершинности к выраженной островершинности.

Таким образом, сложно выбрать какой-то единый статистический параметр для определения содержания жира ввиду несистемности и сравнительной малости изменений. Другим существенным недостатком использования параметров поглощения является необходимость измерения всего спектра η(λ) и сложность расчетов.

Поэтому для дальнейших исследований следует измерить длины волн наибольшего возбуждения λ в и спектральные характеристики фотолюминесценции φ(λ).

В качестве примера спектры люминесценции зерна пшеницы с различным содержанием жиров при возбуждении λ в = 362 нм представлены на рисунке 2.

Все спектры люминесценции имеют по одному максимуму: для λ в = 290 нм – примерно на 344 нм, для λ в = 362 нм – на 447 нм, для λ в = 414 нм – на 515 нм. Из-за наличия тушения люминесценции при увеличении концентрации жира характеристики смещаются вниз, качественно не меняясь. Аналогично для размолов овса и ячменя.

Рассчитаны интегральные параметры спектральных характеристик размолов пшеницы при возбуждении λ в = 290 нм в диапазоне 360– 500 нм, λ в = 362 нм – 410–600 нм, λ в = 414 нм – 490–650 нм. Результаты представлены в таблице 2.

λ, нм

Рис. 2. Спектры люминесценции фуражного зерна пшеницы с различным содержанием жиров при возбуждении λ в = 362 нм

Luminescence spectra of feed wheat grain with different fat content under excitation λ e = 362 nm

Таблица 2

Потоки фотолюминесценции размолов пшеницы с различной концентрацией жира Photoluminescence flux of wheat grinds with different fat concentrations

C F , %	Φ±ΔΦ, о. е., для λ в , нм
	290	362	414
1,5	361±25	760±63	383±25
6,7	178±9	633±46	290±16
9,4	209±16	568±46	252±16
12,3	180±10	511±30	206±8
15,5	154±13	473±34	181±11
17,5	121±8	427±30	169±11

Относительная погрешность определения потоков Φ λ составляет не более 8,4 % для Φ 290 , 8,3 – для Φ 362 и 6,5 % – для Φ 414 и в дальнейшем может быть уменьшена за счет увеличения числа измерений потока фотодиодами.

Теоретически для исследованных образцов корма c разной концентрацией жира уменьшение потока фотолюминесценции может быть объяснено тушением люминесценции при увеличении концентрации связанного жира в приповерхностных тканях. Статическое тушение обусловлено образованием нелюминесцирую-щего продукта в результате взаимодействия люминофора с тушителем. При одинаковом коэффициенте поглощения люминофора и тушителя величина выхода люминесценции в отсутствие тушителя обратно пропорциональна выходу люминесценции в присутствии тушителя (в данном случае жира). Таким образом, в данном экспериментальном исследовании подтверждена обратная зависимость величины возбуждения (и зависящей от него люминесценции) от содержания жира.

Практически зависимости Φ(CF) для всех длин волн возбуждения получились падающими, но для λв = 290 нм статистически достоверную аппроксимацию (R2 = 0,88) удалось получить только для более сложной степенной функции. Для возбуждения излучением 362 и 414 нм получились линейные зависимости с коэффициентами детерминации 0,99 и 0,97 соответственно. Чувствительность функции для λв = 414 нм на 31 % выше, но уровень исходного фотосигнала в 2 раза ниже, чем при возбуждении 362 нм.

Результаты расчета интегральных параметров спектральных характеристик размолов овса и ячменя различной жирности представлены в таблице 3.

Таблица 3

Потоки фотолюминесценции размолов овса и ячменя с различной концентрацией жира Photoluminescence flux of milled oats and barley with different fat concentrations

C F , %	Φ±ΔΦ, о. е., для λ в , нм
	282	362	424
Овес
4,08	193±18	539±52	508±29
5,66	174±16	501±32	505±65
7,05	169±12	492±31	439±45
8,96	156±7	472±25	451±31
10,50	144±10	457±41	433±35
12,80	123±7	413±26	365±17
14,36	113±6	372±21	318±44
17,40	88±9	324±36	295±24
Ячмень
1,89	151±14	441±63	342±18
4,56	137±11	416±32	288±20
7,36	118±14	408±58	281±18
9,16	102±14	331±47	262±13
11,60	92±13	344±70	248±17
13,10	85±9	332±58	246±15
15,28	78±12	330±69	233±12
17,14	68±8	314±55	231±8

Для всех трех использованных длин волн излучения возбуждения овса (282 нм, 362 и 424 нм) зависимости потоков от содержания жира статистически достоверно были аппроксимированы линейными функциями с коэффициентами детерминации 0,99, 0,98 и 0,94 соответственно. При этом наибольшая чувствительность получилась для λв = 282 нм, но величины потока Φ282 и линейно зависящие от них фотосигналы меньше, чем для других длин волн возбуждения в 2,7–3,7 раза. Наиболее предпоч- тительным является использование длин волн возбуждения 362 и 424 нм.

Для ячменя, как и для овса, при всех длинах волн возбуждения получили падающие зависимости потока от содержания жира, линейно аппроксимируемые с высокой статистической достоверностью. Наибольшая чувствительность получилась также для коротковолнового возбуждения 282 нм, но с меньшим уровнем фотосигнала.

В качестве примера зависимости Φ 362 ( C F ) для всех исследованных видов зерна представлены на рисунке 3.

Рис. 3. Зависимости потоков фотолюминесценции Φ362 от концентрации жира в размолах зерна пшеницы (1), овса (2) и ячменя (3) Dependences of photoluminescence fluxes Φ362 on fat concentration in grain grinds of wheat (1), oats (2) and barley (3)

Из анализа полученных результатов следует, что для определения концентрации жира в размолах исследованных концентрированных растительных кормов необходимо использовать потоки фотолюминесценции Φλ. Для других видов концентрированных кормов следует проводить аналогичные измерения с последующим расчетом параметров. Выбор конкретной длины волны возбуждения осуществляется из компромиссных соображений между максимальной чувствительностью, величиной потока (фотосигнала) и коэффициента детерминации, а также минимальной погрешностью. Другим немаловажным аспектом является возможность технической реализации и универсализации метода определения и реализующего его прибора. Так, коротковолновые источники излучения (282–290 нм) являются более дорогими и менее доступными, что затрудняет поиск компонентного состава прибора. Кроме того, в связи с тем, что фотолюминесцентный сигнал сравнительно мал, абсолютное значение потока Φλ имеет очень важное значение, в то время как погрешность его измерения ΔΦλ может быть существенно уменьшена при многократных интегральных измерениях с быстродействующими свето-и фотодиодами. С этой точки зрения следует отдавать предпочтение длинноволновому возбуждению 362 и 414/424 нм, однако для универ- сализации компонентной базы более выгодным будет использование единого источника излучения для нескольких видов зерна, поэтому наиболее эффективным является излучение с длиной волны 362 нм.

Заключение. При увеличении концентрации жира в 4,3–11,7 раза качественные параметры характеристик поглощения всех видов зерна меняются примерно одинаково и незначительно, в то время как количественно характеристики уменьшаются, смещаясь вниз, а интегральная поглощательная способность падает в 1,8– 2,1 раза. При этом из-за тушения люминесценции спектральные характеристики фотолюминесценции, не меняясь качественно, смещаются вниз. Зависимости интегральных потоков фотолюминесценции от концентрации жира для всех исследованных размолов зерна статистически достоверно (коэффициенты детерминации 0,852–0,995) могут быть аппроксимированы линейными функциями. Для создания метода и универсального прибора контроля содержания жира в зерновых кормах из компромиссных соображений наиболее целесообразным является использование потоков фотолюминесценции при возбуждении излучением 362 нм.