Определение противовирусных свойств комплексного фитоэкстракта

Необходимость определения противовирусных свойств гепатопротективных препаратов определяется широкой распространенностью вирусных инфекций [1, 2]. Повреждение печени развивается при вирусных гепатитах А, В, С, D, E и F, воздействии цитомегаловирусов, вирусов Эпштейна — Барр, аденовирусов и др. Нередко развиваются затяжные и хронические формы с тяжелыми последствиями, особенно для групп риска. Авторы отмечают ограниченное количество этиотропных противовирусных препаратов при подавляющем большинстве инфекций, что определяет актуальность поиска средств, сочетающих гепатопротективные свойства и противовирусный эффект. Комплексный фитоэкстракт «Гипелив» продемонстрировал отчетливое гепатопротективное действие в экспериментальных условиях, способность оказывать антиоксидантное, мембраностабилизирующее действие, снижать выраженность основных патогенетических синдромов повреждения печени [3].

Цель работы заключалась в определении противовирусных свойств комплексного фитосредства «Гипелив», обладающего гепатопротективным действием, in vitro в культуре клеток.

Методы. Определение противовирусного действия комплексного экстракта проводили с помощью микрометода в культуре клеток НЕР-2 эпидермоидной карциномы гортани человека, культивируемой в виде монослоя (ООО «БиолоТ» РФ, Санкт-Петербург) [2]. Культуру клеток инкубировали в пластиковых панелях с 96 лунками с плоским дном (КНР) с добавлением по 0,1 мл поддерживающей питательной среды Игла МЕМ с L-глютамином (ООО «БиолоТ» РФ, Санкт-Петербург).

Для выявления возможного цитопатогенного воздействия исследуемого экстракта сухого на культуру тканей определяли степень деструкции клеточного монослоя при добавлении в поддерживающую питательную среду «Гипелива» и его компонентов. Содержание культуры клеток осуществлялось в течение 48‒72 часов при 36 °С и 5% СО2, после чего определяли степень деструкции клеточного монослоя при помощи микроскопирования.

Оценка противовирусных свойств экстракта «Гипелив» и его компонентов осуществлялась на основе микрометода при использовании энтеровирусов с учетом ЦПД. Вначале проводилась предварительная обработка 24-часовой культуры клеток, выращенной в 96 луночных пластиковых панелях, разными концентрациями растворенного «Гипелива» и его компонентов, начиная с концентрации 900 мкг/мл за сутки до заражения вируссодержащей жидкостью. Необходимость предварительного внесения исследуемого экстракта и его компонентов в культуру за 24 часа до инфицирования вирусом связана с тем, что развитие максимального протективного эффекта указанных веществ наступает не ранее чем через 10 ч после внесения.

В дальнейшем при внесении вируссодержащей жидкости к культуре клеток, содержащей исследуемые экстракты в данной концентрации, через 48–72 часа

(сроки максимального накопления вируса) культуру микроскопировали для определения противовирусной активности по ЦПД.

Результаты и их обсуждение

При выявлении цитопатогенного действия «Гипелива» и его компонентов на культуру клеток при добавлении в питательную поддерживающую среду исследуемого сухого экстракта и его компонентов в дозе 900 мкг/мл установлено полное отсутствие ЦПД.

Определение противовирусного действия изучаемого экстракта проводили с помощью микрометода в культуре клеток НЕР-2 эпидермоидной карциномы гортани человека. Через 48 часов после внесения вируссодержащей жидкости наблюдение и микроскопирование позволили отметить уменьшение цитопатогенного действия вируса (ЦПД) при добавлении в питательную поддерживающую среду «Гипелива» в дозе 900 мкг/мл на 40%. Добавление сухого экстракта гипекоума прямого и копеечника альпийского сопровождалось уменьшением ЦПД на 10%. При внесении в питательную среду сухих экстрактов календулы лекарственной и солодки уральской и «Гипелива» наблюдалось уменьшение ЦПД на 50%, «Гипелива» — на 62% по сравнению с контролем, что свидетельствует об отчетливой антивирусной активности данной концентрации. Через 72 часа после внесения вируссодержащей жидкости отмечалось выраженное ЦПД на культуру клеток (табл. 1).

Таблица 1

Противовирусная активность и цитопатогенное действие экстракта сухого «Гипелив» и его компонентов в концентрации 900 мкг/мл на культуре клеток

Культура клеток + исследуемый экстракт сухой + вируссодержащая жидкость	ЦПД
	Сроки наблюдения
	48 ч	72 ч
Шлемник байкальский	100%	100%
Гипекоум прямой	90%	100%
Календула лекарственная	50%	100%
Солодка уральская	50%	100%
Копеечник альпийский	90%	100%
Экстракт сухой «Гипелив»	38%	100%

На основании полученных данных установлено, что 50%-ная ингибирующая концентрация экстрактов календулы лекарственной, солодки уральской составляет 900 мкг/мл, при этом репродукция вируса снижалась вдвое через 48 часов, а при введении «Гипелива» в той же концентрации — на 62% (табл. 1).

Для установления диапазона противовирусной активности «Гипелива» и его составляющих опытным путем в зависимости от токсичности на культуру клеток с постепенным увеличением концентрации, с кратностью разведения 1 : 2, начиная с концентрации 900 мкг/мл, подбирали концентрацию с максимальной антивирусной активностью. Постепенно увеличивали концентрацию сухих экстрактов от 1000 мкг/мл до 10 мг/мл, 20 мг/мл и выше. Таким образом, был определен оптимальный диапазон противовирусной активности «Гипелива» и его компонентов в пределах от 20 до 40 мг/мл.

При определении ЦПД на культуру клеток экстракта сухого и его компонентов в концентрации 20 мг/мл выявлено, что введение «Гипелива» и солодки уральской практически не приводило к гибели культуры клеток (табл. 2). При введении в культуру клеток сухих экстрактов гипекоума прямого, календулы лекарственной и «Гипелива» отмечали ЦПД в пределах 10%, что свидетельствовало о слабом ци-топатическом эффекте. Введение экстракта шлемника байкальского и гипекоума прямого оказывало более значительное ЦПД (до 30%), выраженную токсичность демонстрировал сухой экстракт копеечника альпийского и гипекоума прямого.

Через 48–72 часа после добавления вируссодержащей жидкости на фоне введения «Гипелива» и компонентов в концентрации 20 мг/мл выявлено значительное уменьшение ЦПД при введении экстракта солодки уральской, календулы лекарственной и «Гипелива». В первые 24 часа после инфицирования вирус в культуре клеток накапливался в незначительных концентрациях, не вызывая выраженной деструкции клеток. Через 48 ч после инфицирования монослоя клеток эффективность подавления ЦПД при добавлении экстракта солодки и календулы составила 73%, «Гипелива» — 81%. Через 72 часа при использовании экстракта солодки и календулы лекарственной подавление цитопатической активности вируса в дальнейшем возрастало и достигло 50%, при введении «Гипелива» — 40%.

Таблица 2

Противовирусная активность и цитопатогенное действие сухого экстракта «Гипелив» и его компонентов в концентрации 20 мг/мл

Экстракты сухие	ЦПД
	Культура клеток + сухие экстракты	Культура клеток + сухие экстракты + вируссодержащая жидкость
		Срок 48 ч	Срок 72 ч
Шлемник байкальский,	30%	100%	100%
Гипекоум прямой	30%	90%	100%
Календула лекарственная	10%	27%	50%
Солодка уральская	5%	27%	50%
Копеечник альпийский	50%	100%	100%
Экстракт сухой «Гипелив»	9%	19%	60%

Следовательно, одновременное изучение цитотоксических и противовирусных свойств экстракта «Гипелив» и его компонентов позволило установить наличие противовирусного потенциала, причем наибольшая способность подавления ЦПД вируса выявлена у экстрактов солодки, календулы и изучаемого экстракта.

Данные о влиянии «Гипелива» и его компонентов на культуру клеток в концентрации 40 мг/мл позволили отнести его к малотоксичным соединениям, ЦПД не превышал 10% (табл. 3). При добавлении вируссодержащей жидкости через 48 часов ЦПД составляло 90%.

Таблица 3

Противовирусная активность комплексного экстракта и его компонентов в концентрации 40 мг/мл

Сухие экстракты	ЦПД
	Культура клеток + сухие экстракты	Культура клеток + сухие экстракты + вируссодержащая жидкость
		48 ч	72 ч
Шлемник байкальский	70%	100%	100%
Гипекоум прямой	50%	100%	100%
Календула лекарственная	20%	100%	100%
Солодка уральская	20%	100%	100%
Копеечник альпийский	60%	100%	100%
Экстракт сухой «Гипелив»	20%	90%	100%

На основании полученных данных установлено, что 50%-ная ингибирующая концентрация экстрактов календулы лекарственной и солодки уральской составляет 900 мкг/мл, при этом репродукция вируса снижалась вдвое. При использовании экстракта солодки в концентрации 20 мкг/мл в первые 24 ч после инфицирования вирус в культуре клеток накапливался в незначительных концентрациях, не вызывая значительной деструкции клеток. Через 48 ч после инфицирования монослоя клеток эффективность подавления вируса при добавлении экстракта солодки и календулы лекарственной составила 27%.

Таким образом, изучение цитотоксических и противовирусных свойств экстракта «Гипелив» и его компонентов позволило установить наличие значительного противовирусного потенциала указанных веществ, причем наибольшая способность подавления ЦПД вируса выявлена у экстрактов солодки и календулы и изучаемого экстракта.