Оптимизация ультразвуковой водной экстракции фенольных соединений из ягод облепихи (Hippophae rhamnoides L.) методом Бокса—Бенкена

Облепиха крушиновидная ( Hippophae rhamnoides L. ) является одним из наиболее ценных видов дикорастущих плодово-ягодных растений, распространённых в умеренном климате Евразии. Ягоды облепихи содержат широкий спектр биологически активных веществ, включая витамины, каротиноиды, органические кислоты, флавоноиды и другие фенольные соединения [1, 2, 20]. Фенольные соединения облепихи проявляют выраженную антиоксидантную, противовоспалительную и антимикробную активность, что определяет перспективность их использования в пищевой, фармацевтической и косметической промышленности [3, 4].

Плоды облепихи характеризуются высоким содержанием органических кислот, которые влияют на вкус, стабильность и состав экстрактов [21].

В настоящее время актуальной задачей является разработка эффективных технологий извлечения биологически активных веществ из растительного сырья. Традиционные методы экстракции часто характеризуются низкой эффективностью, длительностью процесса и высокими энергозатратами [5]. Ультразвуковая экстракция (УЗ-экстракция) является перспективной альтернативой традиционным методам, поскольку позволяет интенсифицировать процесс массообмена за счёт явления акустической кавитации [2, 6, 7]. При схлопывании кавитационных пузырьков возникают локальные зоны высокого давления и температуры, что приводит к разрушению клеточных стенок растительного сырья и ускорению диффузии целевых компонентов в экстрагент [8].

Перспективным направлением является также вовлечение в переработку побочных продуктов (шрота, жома и вегетативных частей) с целью расширения сырьевой базы и повышения ресурсной эффективности технологий [22].

Wu и соавт. [1] показали, что выбор растворителя и условий экстракции существенно влияет на фенольный профиль и антиоксидантную активность экстрактов облепихи. Sanwal и соавт. [11] оптимизировали параметры ультразвуковой экстракции масла из семян облепихи, продемонстрировав возможность повышения выхода биологически активных веществ. Hosni и соавт. [10] применили метод Бокса-Бенкена для оптимизации УЗ-экстракции антиоксидантов из Melastoma malabathricum , достигнув значительного увеличения выхода фенольных соединений.

Метод поверхности отклика (Response Surface Methodology, RSM) является эффективным статистическим инструментом для оптимизации многофакторных процессов [15, 16, 19]. Планирование эксперимента по Боксу-Бенкену позволяет минимизировать число опытов при построении адекватных математических моделей, описывающих влияние технологических факторов на целевые показатели [15, 16].

Несмотря на значительное число работ, посвящённых экстракции биологически активных веществ из облепихи, в литературе недостаточно представлены комплексные исследования по оптимизации параметров ультразвуковой водной экстракции фенольных соединений с применением погружных ультразвуковых излучателей (сонотродов). Водная экстракция является более безопасной, экологичной и экономически целесообразной альтернативой использованию органических растворителей, особенно для пищевых применений [17].

Цель работы – оптимизация параметров ультразвуковой водной экстракции фенольных соединений из ягод облепихи с использованием сонотрода методом планирования эксперимента Бокса-Бенкена

Материалы и методы

Материалы исследования. В качестве объекта исследования использовали ягоды облепихи крушиновидной ( Hippophae rhamnoides L .) урожая 2024 года. Ягоды были собраны в стадии полной зрелости, промыты фильтрованной водой, высушены и измельчены до размера частиц 2–3 мм.

Планирование эксперимента. Для оптимизации процесса экстракции применяли метод планирования эксперимента Бокса-Бенкена с тремя факторами на трёх уровнях. В качестве независимых переменных были выбраны:

• •    x₁ – температура экстракции, °C (50, 70, 90);

• •    x₂ – время ультразвуковой обработки сонотродом, мин (0, 2.5, 5);

• •    x₃ – гидромодуль, соотношение вода: сырьё (1:10, 1:15, 1:30).

Общее время экстракции составляло 45 минут. Ультразвуковая обработка проводилась в начале процесса в течение заданного времени, после чего экстракция продолжалась при постоянном перемешивании.

Матрица планирования включала 15 экспериментов: 12 факторных точек и 3 повтора в центре плана для оценки ошибки эксперимента.

Методика экстракции. Навеску измельчённых ягод облепихи помещали в стеклянный стакан объёмом 250 мл, добавляли дистиллированную воду в соответствии с заданным гидромодулем. Ультразвуковую обработку проводили погружной ультразвуковой установкой (И100–6/4 (производитель ООО «Ультразвуковая техника – ИНЛАБ», Россия) при заданной температуре и времени обработки. После ультразвуковой обработки экстракцию продолжали при постоянном перемешивании на магнитной мешалке до достижения общего времени 45 минут. По окончании процесса экстракт охлаждали, фильтровали через бумажный фильтр «синяя лента» и доводили объём до метки дистиллированной водой.

Определение общего содержания фенольных соединений (ОСФС). Определение проводили по методу Фолина-Чокальтеу в соответствии с ГОСТ Р ИСО 14502–1–2010. К 1 мл разбавленного раствора экстракта добавляли 5 мл 10% реактива Фолина–Чокальтеу (разбавленного 1:9). Через 3–8 мин добавляли 4 мл 7.5% раствора карбоната натрия и выдерживали в темноте в течение 60 мин при комнатной температуре. Оптическую плотность измеряли при длине волны 765 нм на спектрофотометре. Калибровочный график строили по раствору галловой кислоты (0.5 мг/мл). Результаты выражали в мг эквивалента галловой кислоты на г навески сырья (мг ГК/г) [5].

Определение содержания сухих веществ (СВ) Содержание сухих веществ определяли гравиметрическим методом путём высушивания навески экстракта массой 5 г при температуре 105 °C до постоянной массы. Результаты выражали в процентах.

Определение антирадикальной активности методом DPPH (IС50). Антирадикальную активность определяли по способности экстрактов ингибировать стабильный радикал 2,2 – дифе-нил-1-пикрилгидразил (DPPH). К 0.05 мл образца добавляли 3.95 мл раствора DPPH в метаноле (0.1 мг/мл) в пробирке. Через 60 мин инкубации при комнатной температуре измеряли оптическую плотность при длине волны 518 нм. Контрольную пробу готовили аналогично, заменяя образец на метанол. Измерения проводили в трёх повторностях [12].

A,™ -A A

FRSA = DPH ----образец _x 100%     (i)

DPPH где A    – оптическая плотность контрольного раствора DPPH; A     – оптическая плотность раствора с образцом.

Для определения значения IС50 производились измерения FRSA в 5 точках для построения калибровочного графика.

Для описания зависимости откликов от факторов использовали полиномиальные модели второго порядка:

kk

• Y=bo+Ях+Ybx+Tim (2)

i = 1             i = 1               i <  j

Расчёт коэффициентов регрессии и оценку адекватности моделей проводили с использованием программного обеспечения Python. Качество моделей оценивали по коэффициенту детерминации R² и скорректированному R².

Результаты и обсуждение

В таблице 1 представлена матрица планирования эксперимента с экспериментальными значениями откликов.

Таблица 1.

План эксперимента и экспериментальные значения откликов

Table 1.

Experimental design and response values

Опыт Test	XI: Температура, °C Temperature °C	Х2: УЗ (мин) US (min)	Х3: Гидромодуль (1:Y) Solid-to-liquid ratio (1:Y)	XI	Х2	Х3	IС50, мг/мл mg/ml	СВ,% DM. %	ОСФС, мг ГК/г навески TPC, mg GAE/g
1	50	0	15	-1	-1	0	11,8	1,95	14,2
2	90	0	15	1	-1	0	7,2	2,25	20,5
3	50	5	15	-1	1	0	12,5	2,45	13,5
4	90	5	15	1	1	0	5,4	1,95	21,8
5	50	2,5	10	-1	0	-1	12,1	3,15	13,8
6	90	2,5	10	1	0	-1	7,6	3,85	20,9
7	50	2,5	30	-1	0	1	11,2	0,75	14,6
8	90	2,5	30	1	0	1	7,8	1,15	22,8
9	70	0	10	0	-1	-1	11,9	2,95	15,2
10	70	5	10	0	1	-1	11,4	2,9	15,8
11	70	0	30	0	-1	1	10,2	0,85	17,3
12	70	5	30	0	1	1	10,8	1,2	18,5
13 (Ц)	70	2,5	15	0	0	0	11,2	2,05	16,1
14 (Ц)	70	2,5	15	0	0	0	10,95	1,95	15,9
15 (Ц)	70	2,5	15	0	0	0	11,1	2	16

На основе экспериментальных данных построены редуцированные математические модели (после исключения незначимых членов).

Модель для антирадикальной активности (IС50):

Y_IC5o = 11,08 - 2,45 ^ - 0,13 x ₂ - 0,38 x ₃ - 1,63 x²

- 0,23 x ₂² + 0,22 x ₃² - 0,63 x 1 x 2 + 0,28 x₃x ₃ + 0,28 x₂x₃

Y_IC5o = 11,08 - 2,45 x - 1,63 x²

R ² = 0,964; R ² ^ = 0,898

Температура экстракции ( x ) оказывает решающее влияние на антиоксидантную способность: коэффициент – 2,45 указывает на то, что при повышении температуры значение IС50 интенсивно снижается, что эквивалентно росту активности экстракта. Наличие значимого отрицательного квадратичного эффекта (x2 = -1,63, p = 0,006) свидетельствует о нелинейном характере зависимости: при приближении к 90 °С скорость улучшения показателя возрастает. Факторы времени ультразвуковой обработки ( x ) и гидромодуля ( x ) в данных условиях оказались статистически незначимыми (p > 0,05).

Рисунок 1. Поверхность отклика и контурный график для IС50 (зависимость от х1 и х2 при х3 = 15)

Figure 1. Response surface and contour plot for IС50 (dependence on х1 and х2 at х3 = 15)

Модель для общего содержания фенольных соединений (TPC):

Y_{TP с} = 16,00 + 3,74 x + 0,30 x₂ + 0,94 x₃ + 1,41 x₁² + 0,09 x 2 2 + 0,61 x 3² + 0,50 xx + 0,28 xx + 0,15 x₂x₃ Y_TPc = 16,00 + 3,74 x + 0,94 x ₃ + 1,41 x₁ ² + 0,61 x₃²

R ² = 0,994; R ² _adj = 0,983

На выход полифенольных соединений статистически значимое влияние оказывают температура ( x ) и гидромодуль ( x ). Температура является доминирующим фактором (линейный эффект +3,74). Гидромодуль также вносит значимый положительный вклад (+0,94, p = 0,001). Обе зависимости носят выраженный криволинейный характер, о чем свидетельствуют положительные квадратичные коэффициенты ( x 2 и x 2 ). Это указывает на ускорение экстракции при переходе к верхним границам факторов. В отличие от предыдущих моделей, время ультразвуковой обработки ( x ) здесь близко к порогу значимости (p = 0,089 ), однако формально считается незначимым. Эффекты взаимодействия между факторами не выявлены.

Рисунок 2. Поверхность отклика и контурный график для ОСФС (зависимость от х1 и х3 при х2 = 2.5)

Figure 2. Response surface and contour plot for OSF (dependence on х1 and х3 at х2 = 2.5)

Модель для содержания сухих веществ (СВ):

Y_dm = 2,00 + 0,11 x , + 0,06 x ₂ - 1,11 x ₃ + 0,20 x 2 -

• - 0,05 x 2 + 0,03 x ₃2 - 0,20 xx - 0,08 xx + 0,10 x₂x₃

Y DM = 2,00 - 1,11x 3

R ² = 0,960; R 2_ad, = 0,889

Содержание сухих веществ в данной системе практически полностью определяется гидромодулем ( x ). Отрицательный коэффициент (-1,11) при высокой значимости ( p <  0,001 )

подтверждает действие эффекта разбавления: увеличение объема растворителя закономерно снижает концентрацию сухих веществ. Все остальные факторы (температура и время УЗ) и их взаимодействия статистически незначимы ( p >  0,05 ). Модель обладает высокой предсказуемостью ( R ² = 0,960 ), описывая процесс как строго линейный.

В таблице 2 приведены оптимальные значения факторов для различных критериев оптимизации.

В: Контурный график для СВ Contour plot for DM

Температура (xl), "С Temperature (xl), =C

Рисунок 3. Поверхность отклика и контурный график для СВ (зависимость от х1 и х3 при х2 = 2.5)

Figure 3. Response surface and contour plot for SV (dependence on х1 and х3 at х2 = 2.5)

Таблица 2.

Оптимальные параметры экстракции

Table 2.

Optimal extraction parameters

Критерий	Температура, °C	Время УЗ, мин	Гидромодуль	Прогноз
Criterion	Temperature, °C	US time, min	Ratio	Prediction
Минимум IС50 / Min IС50	90	любое / any	1:12–15	IС50 ≈ 5,4 – 7,6
Максимум TPS / Max TPS	90	любое / any	1:30	ОСФС ≈ 22 мг ГК/г
Максимум СВ / Max DM	90	любое / any	1:10	СВ ≈ 2.2%
Компромисс / Compromise	90	0–2.5	1:15–20	IС50 ≈ 10, ОСФС ≈ 16 мг ГК/г

Полученные результаты согласуются с данными литературы о влиянии температуры на эффективность экстракции фенольных соединений. Wu и соавт. [1] при оптимизации экстракции облепихи также установили положительное влияние температуры на антиоксидантную активность. В нашем исследовании повышение температуры от 50 до 90 °C снижает IС50 примерно на 39%.

Важным результатом является установление статистической незначимости времени ультразвуковой обработки для всех откликов. Это согласуется с данными Hosni и соавт. [10], показавших, что при УЗ-экстракции 80% целевых соединений извлекается в первые минуты обработки. Отсутствие значимого эффекта времени УЗ может быть объяснено тем, что даже кратковременное воздействие сонотрода достаточно для разрушения клеточных структур, а дальнейшее увеличение времени не повышает выход целевых компонентов.

Выявлен конфликт оптимумов для IС50 и ОСФС: максимальная антирадикальная активность достигается при более низком гидромодуле, тогда как максимальное содержание фенолов – при более высоком гидромодуле. Это требует выбора приоритетного критерия или использования компромиссного режима в зависимости от целевого назначения экстракта.

Адекватность разработанных моделей подтверждается значениями R² = 0.889–0.983.

По данным литературы [15] отмечают, что значения R²adj > 0.70 свидетельствуют о хорошей предсказательной способности модели.

Водная экстракция с применением сонот-рода является перспективной для производства пищевых продуктов, поскольку исключает использование органических растворителей и позволяет сократить время обработки [17, 18].

Заключение

• 1.    Разработаны адекватные математические модели второго порядка, описывающие зависимость антирадикальной активности IС50 (R² = 0.898), общего содержания фенольных соединений ОСФС (R² = 0.983) и содержания сухих веществ DM (R² = 0.889) от параметров экстракции.

• 2.    Установлено, что температура экстракции является наиболее значимым фактором для IС50 (-2,45) и для ОСФС (+3,74). Время ультразвуковой обработки сонотродом в диапазоне 0–5 мин статистически незначимо для всех откликов.

• 3.    Определены оптимальные параметры: для максимизации антирадикальной активности – температура 90 °C, гидромодуль 1:12–15 (IС50 ≈ 5,4 – 7,6); для максимизации выхода фенольных соединений – температура 90 °C, гидромодуль 1:30 (ОСФС ≈ 22 мг ГК/г).

• 4.    Незначимость времени УЗ-обработки позволяет минимизировать энергозатраты производства без снижения качества экстракта.