Полиморфизм генов каппа-казеина и диацилглицерол о-ацилтрансферазы у черно-пестрого скота

Введение. Открытие полиморфизма белков, ферментов у крупного рогатого скота явилось сильным толчком для изучения генетических особенностей пород и возможностей использования генов-маркеров в практической селекции. К настоящему времени благодаря быстрому внедрению биотехнологии общее число выявленных у животных ДНК-маркеров уже достигло множества, что позволяет надежно контролировать значительную часть ее генома [1-2].

Гены молока являются высокополиморфными и существуют в нескольких аллельных вариантах. Большое число исследований посвящено изучению связи полиморфизма генов-маркеров молока с продуктивностью молочного скота [3-6].

Ген белка каппа-казеина связан с признаками белковомолочности и технологических свойств молока. Структура κаппа-казеина контролируется одним полиморфным геном, расположенным в 6 хромосоме генома крупного рогатого скота [7].

Ген каппа-казеина (CSN3) отвечает за синтез каппа-казеина у крупного рогатого скота, каппа-казеин занимает особое место среди составных частей казеина [8].

Частота встречаемости различных аллельных вариантов по гену каппа-казеи-на значительно меняется в зависимости от породы, региона и страны. Так, в молочных породах встречаемость А и В аллелей каппа-казеина составляет 0,790 и 0,210 соответственно [9-10].

В Республике Татарстан частота встречаемости генотипов по гену CSN3 у крупного рогатого скота голштинской породы составила: АА – 36,0%, АВ – 53,3% и ВВ – 10,7% [11]. У холмогорской породы татарстанского типа: АА – 78%, АВ – 16% и ВВ всего 6%. [12]. У черно-пестрой породы: АА – 55,3-66,4 %, АВ – 30,3-40,4% и ВВ ‒ 3,3‒4,3 % [13].

Анализ полиморфизма по гену каппа-казеина популяции коров и быков-производителей белорусской чёрно-пёстрой породы показал, что распространённость аллелей составила: А – 0,84-0,88 и В – 0,12-0,16 [14].

Ген диацилглицерол О-ацилтрансферазы (DGAT1) локализован на 14 хромосоме генома Bos taurus и определен как генетический маркер, влияющий на качественные показатели молока. Данный ген DGAT1 используется в биосинтезе липидов и связан с жирномолочностью коров [15].

Аллель, содержащий лизин в 232 положении, является наиболее желательным, так как коровы, имеющие данный аллель с генотипом DGAT1 КК и КА, дают более жирное молоко, чем гомозиготные животные с генотипом DGAT1 АА, содержащий аллель, где в 232 положении располагается аланин [16-19].

Генетический полиморфизм необходимо учитывать при изучении специфических особенностей линий с целью ускорения селекционного прогресса. Это позволит установить перспективы применяемых методов селекции и использовать в работе при создании животных желательного типа [20].

В связи с этим генотипирование крупного рогатого скота по генам-маркерам следует использовать не только в масштабах популяции в целом, но и по отдельным генеалогическим линиям, разводимым в конкретном хозяйстве. При этом есть возможность проведения отбора животных с учетом генотипа по ДНК-маркерам при сохранении заданной линейной структуры стада [21-22].

Цель исследований ‒ изучение полиморфизма и определения частоты встречаемости аллельных вариантов по генам каппа-казеина и диацилглицерол О-ацилтрансферазы у разных возрастных групп и генеалогических линий молочного скота.

Материал и методы исследований. Исследования были проведены в стаде черно-пестрого скота племенного репродуктора ООО «Дусым» Атнинского района Республики Татарстан.

Объектом исследований являлись первотелки (139 гол.) и высокопродуктивные коровы (203 гол.) племенного ядра. Для проведения исследований опытный скот был генотипирован по гену каппа-казеина (CSN3) и диацилглицерол О-ацилтрансферазы (DGAT1) методом ДНК-диагностики.

Исследуемое поголовье молочного скота относилось к генеалогическим линиям голштинской породы: Вис Бэк Айдиал 101341, Монтвик Чифтейн 95679, Реф-лекшн Соверинг 198998, С.Т. Рокита 252803.

Материалом для молекулярного ДНК-тестирования служила венозная кровь животных. Выделение ДНК проводилось с помощью набора «Магносорб» (Интер-лабсервис, Москва) согласно инструкции производителя. Амплификацию проводили на детектирующем амплификаторе ДТ-96 и «Терцик» («ДНК-технология», Москва). Использовали ПЦР-смесь следующего состава: пару праймеров для амплификации участка исследуемого гена, смесь нуклеозид трифосфатов (2,5 мМ), хлорид магния (25 мМ), 10-кратный буфер для проведения ПЦР, Taq полимеразу.

Для амплификации фрагментов генов CSN3 и DGAT1 использовали следующие пары олигонуклеотидных праймеров, синтезированных в ЗАО «Синтол» (Москва, Россия):

• 1.    Для гена CSN3 [23]:

• -    прямой праймер 5’-ATAGCCAAATATATCCCAATTCAGT -3’

• -    обратный праймер 5’-TTTATTAATAAGTCCATGAATCTTG -3

• 2.    Для гена DGAT1 [24]:

• -    прямой праймер 5’-GCTGCTCCTGAGGGCCCTTCG-3’

• -    обратный праймер 5’-GCGGCGGCACTTCATGACCCT-3’

Амплификацию с этими праймерами проводили по следующей программе: для фрагмента гена CSN3 первый цикл – 95 °С, 5 мин; последующие 35 циклов: денатурация – 30 с при 95 °С, отжиг – 50 с при 63 °С, синтез – 30 с при 72 °С ; элонгация – 5 мин при 72 °С; для фрагмента гена DGAT1 первый цикл – 95 °С, 5 мин; последующие 35 циклов: денатурация – 30 с при 95 °С, отжиг – 30 с при 57 °С, синтез – 45 с при 72 °С; элонгация – 7 мин при 72 °С.

Полученные ампликоны подвергали рестрикции при помощи ферментов-ре-стриктаз Hinf I (ген CSN3) и Eae I (ген DGAT1) (СибЭнзим, Россия) согласно рекомендациям производителя.

После рестрикции фрагменты ампликонов подвергали горизонтальному электрофорезу в 2,5-%-ном агарозном геле. Для окрашивания и визуализации фрагментов агарозные гели после электрофореза выдерживали в 0,005 % растворе бромистого этидия в течение 15 минут и фиксировали с помощью системы GelDoc (Bio-Rad, США). Молекулярные массы фрагментов устанавливали по «лестнице»

стандартов молекулярных масс, которые разгоняли параллельно с фрагментами ампликонов.

По результатам генотипирования с учетом линейной принадлежности рассчитали частоту встречаемости по гену каппа-казеина генотипов АА, АВ, ВВ и аллельных вариантов А и В, по гену диацилглицерол О-ацилтрансферазы генотипов АА, АК, КК и аллельных вариантов А и К.

Частоту встречаемости генотипов определяли по формуле:

P = n / N ,                                   (1)

где P – частота определенного генотипа;

n – количество особей, имеющих определенный генотип;

N – общее число особей.

Частоту отдельных аллелей определяли по формуле Е.К. Меркурьевой (1977):

PA= (2nAA+nAB)/2N,                   (2)

QB= (2nBB+nAB)/2N,                  (3)

где PА – частота аллеля А,

QВ – частота аллеля В,

2N – общее число аллелей.

По закону Харди-Вайнберга рассчитывали ожидаемые результаты частот генотипов в исследуемой популяции.

Полученные материалы статистически обработаны с использованием программного приложения Microsoft Excel из программного пакета Microsoft Officе 2007.

Результаты собственных исследований . У первотёлок чёрно-пёстрой породы была определена встречаемость аллелей и генотипов гена каппа-казеина с учётом их линейной принадлежности (табл. 1) .

Таблица 1 ‒ Полиморфизм гена каппа-казеина у черно-пестрого скота, принадлежащих к разным генеалогическим линиям

Генеалогическая линия	n	Частота генотипов, %						Частота аллелей		χ2
		АА		АВ		ВВ		А	В
		n	%	n	%	n	%
Первотелки
В.Б. Айдиала	41	30	73,2	11	26,8			0,87	0,13	1,48
М. Чифтейна				17		5	10,2
Р. Соверинга	36	20	555	14	3348,79	2	5,6	00,7725	00,2285	00,86
С.Т. Рокита						-	-			0,43
Высокопродуктивные коровы
В.Б. Айдиала	61	36	59,0	24	39,4	1	1,6	0,79	0,21	2,24
М. Чифтейна	55	26	47,3	26	47,3	3	5,4	0,71	0,29	0,78
Р. Соверинга	69	39	56,6	25	36,2	5	7,2	0,75	0,25	0,29
С.Т. Рокита	18	12	66,7	6	33,3	-	-	0,83	0,17	1,20

Исследование первотёлок чёрно-пёстрой породы разной линейной принадлежности по голштинской породе показало, что в среднем 55,1‒73,2 % животных несли гомозиготный генотип CSN3 AA, а 26,8‒38,9 % имели гетерозиготный генотип CSN3 AB и только 5,6‒10,2 % обладали гомозиготным генотипом CSN3 BB. Наибольшая встречаемость генотипов CSN3 AA в генеалогической линии В.Б. Айдиала (73,2 %), CSN3 AB в линии Р. Соверинга (38,9 %) и CSN3 BB в линии М. Чифтейна (10,2 %). Наименьшая встречаемость генотипов CSN3 AA в линии Чифтейна (55,1 %), CSN3 AB в линии В.Б. Айдиала (26,8 %) и CSN3 BB в линии Чифтейна (5,6 %). При этом генотип CSN3 BB среди первотёлок линий Айдиала и Рокита не встречал- ся. Частота встречаемости аллелей A и B гена CSN3 в популяции первотёлок линий Айдиала, Чифтейна, Соверинга и Рокита была в пределах 0,72‒0,87 и 0,13‒0,28, соответственно.

Аналогичные исследования, проведённые на высокопродуктивных коровах чёрно-пёстрой породы разной линейной принадлежности по голштинской породе показали, что в среднем 47,3‒66,7 % коров имели генотип CSN3 AA, 33,3‒47,3 % несли генотип CSN3 AB и только 1,6‒7,2 % имели генотип CSN3 BB. Наибольшая встречаемость генотипов CSN3 AA ‒ в линии Рокита (66,7 %), CSN3 AB ‒ в линии Чифтейна (47,3 %) и CSN3 BB ‒ в линии Соверинга (7,2 %). Наименьшая встречаемость генотипов CSN3 AA ‒ в линии Чифтейна (47,3 %), CSN3 AB ‒ в линии Рокита (33,3 %) и CSN3 BB ‒ в линии Айдиала (1,6 %). Причём генотип CSN3 BB среди высокопродуктивных коров линии Рокита не встречался. Частота встречаемости аллелей A и B гена CSN3 в популяции высокопродуктивных коров генеалогических линий Айдиала, Чифтейна, Соверинга и Рокита была в пределах 0,71‒0,83 и 0,17‒0,29 соответственно.

Такие образом, исследования аллельного полиморфизма по гену каппа-казеи-на показали, что среди выборок чёрно-пёстрых первотёлок и высокопродуктивных коров выражено преимущество аллеля A над аллелем B по всем линиям. При этом наибольшая встречаемость желательного аллеля B выявлена среди первотёлок и высокопродуктивных коров генеалогической линии Чифтейна (0,28‒0,29). Результаты исследований показали, что генное равновесие по гену каппа-казеина в популяции чёрно-пёстрых коров с разной линейной принадлежностью не нарушено.

Дополнительно к полиморфизму гена каппа-казеина у животных чёрно-пёстрой породы была определена встречаемость аллелей и генотипов гена диацил-глицерол О-ацилтрансферазы с учётом их линейной принадлежности (табл. 2) .

Исследование первотёлок чёрно-пёстрой породы разной линейной принадлежности по голштинской породе показало, что в среднем 28,6‒53,8 % животных несли гомозиготный генотип DGAT1 AA, 46,2‒65,9 % имели гетерозиготный генотип DGAT1 AK и 2,4-8,3 % обладали гомозиготным генотипом DGAT1 KK. Наибольшая встречаемость генотипов DGAT1 AA в линии Рокита (53,8 %), DGAT1 AK ‒ в линии Айдиала (65,9 %) и DGAT1 KK ‒ в линии Соверинга (8,3 %). Наименьшая встречаемость генотипов DGAT1 AA ‒ в линии Чифтейна (28,6 %), DGAT1 AK ‒ в линии Рокита (46,2 %) и DGAT1 KK ‒ в линии Айдиала (2,4 %). При этом генотип DGAT1 KK среди первотёлок линии Рокита не выявлялся. Частота встречаемости аллелей A и K гена DGAT1 в популяции первотёлок генеалогических линий Айдиала, Чиф-тейна, Соверинга и Рокита была в пределах 0,61‒0,77 и 0,23‒0,39 соответственно.

Таблица 2 ‒ Полиморфизм гена диацилглицерол О-ацилтрансферазы у черно-пестрого скота, принадлежащих к разным генеалогическим линиям

Генеалогическая линия	n	Частота генотипов, %						Частота аллелей		χ2
		АА		АК		КК		А	К
		n	%	n	%	n	%
Первотелки
В.Б Айдиала		13		27	65,9	1	2,4	0,65	0,35	7,51**
М. Чифтейна	4419	14	3218,76	32		3	6,1			7,54**
Р. Соверинга	36	14	389	19	6552,38	3	8,3	00,6615	00,3395	1,43
С.Т. Рокита		7				-	-			2,13
Высокопродуктивные коровы
В.Б Айдиала	61	18	29,5	37	60,7	6	9,8	0,60	0,40	4,53*
М. Чифтейна	55	26	47,3	24	43,6	5	9,1	0,69	0,31	0

Генеалогическая линия	n	Частота генотипов, %						Частота аллелей		χ2
		АА		АК		КК		А	К
		n	%	n	%	n	%
Р. Соверинга     \	69     1	37 1	53,6 1	29 1	42,1 1	3 1	4,3    1	0,75   1	0,25 1	0,70
С.Т. Рокита	18	7	38,9	11	61,1	-	-	0,69	0,31	3,25
* - P<0,05;	** - P<0,01

Аналогичные исследования, проведённые на высокопродуктивных коровах чёрно-пёстрой породы разных генеалогических линий, показали, что в среднем 29,5‒53,6 % коров имели генотип DGAT1 AA, 42,1‒61,1 % несли генотип DGAT1 AK и 4,3‒9,8 % имели генотип DGAT1 KK. Наибольшая встречаемость генотипов DGAT1 AA ‒ в линии Соверинга (53,6 %), DGAT1 AK ‒ в линии Рокита (61,1 %) и DGAT1 KK ‒ в линии Айдиала (9,8 %). Наименьшая встречаемость генотипов DGAT1 AA ‒ в линии Айдиала (29,5 %), DGAT1 AK ‒ в линии Соверинга (42,1 %) и DGAT1 KK ‒ в линии Соверинга (4,3 %). Причём генотип DGAT1 KK среди высокопродуктивных коров линии Рокита не встречался.

Частота встречаемости аллелей A и K гена DGAT1 в популяции высокопродуктивных коров линий Айдиала, Чифтейна, Соверинга и Рокита была в пределах 0,60‒0,75 и 0,25‒0,40 соответственно.

Такие образом, исследования аллельного полиморфизма по гену DGAT1 показали, что среди выборок чёрно-пёстрых первотёлок и высокопродуктивных коров выражено преимущество аллеля A над аллелем K по всем генеалогическим линиям. При этом наибольшая встречаемость аллеля K выявлена среди первотёлок и высокопродуктивных коров линий Чифтейна и Айдиала (0,39‒0,40) соответственно. Однако выявлено достоверное смещение генного равновесия по гену диацилглице-рол О-ацилтрансферазы в поголовье чёрно-пёстрых первотёлок генеалогических линий Айдиала, Чифтейна (P<0,01) и высокопродуктивных коров линии Айдиала (P<0,05) в сторону генотипа DGAT1 AK.

Вывод. Среди чёрно-пёстрого скота выражено преимущество по гену каппа-казеина аллеля A над аллелем B, а по гену диацилглицерол О-ацилтрансферазы аллеля A над аллелем K по всем генеалогическим линиям. При этом наибольшая встречаемость желательного аллеля B CSN3 выявлена среди коров линии М. Чиф-тейна (0,28-0,29) и аллеля K DGAT1 - линий М. Чифтейна и В.Б. Айдиала (0,390,40).