Повышение эффективности экологического мониторинга природной среды путем конструирования новых питательных сред для культивирования легионелл

Болезнь легионеров является острым инфекционным заболеванием, характеризующимся разнообразием клинических - легочных проявлений, возбудителем которого являются факультативные внутриклеточные паразиты – легионеллы.

Биологической особенностью жизненного цикла всех представителей семейства Legionellaceae , является их способность к внуриклеточному паразитированию и размножению. Они проникают в макрофаги и моноциты, препятствуя слиянию эндосом с лизосомами. Тем самым они создают условия для их размножения и транспортировки в упомянутых клетках. Возбудитель поражает только легочную ткань. Содержимое капсулы легионелл относят к факторам агрессии, подавляющим фагоцитоз [1].

Важнейшим фактором успешного выживания ле-гионелл в природных условиях является их существование в составе биопленок, которые широко представлены как в природных водоемах, так и в искусственных водных системах. Они формируются на внутренних поверхностях труб систем водоснабжения, фильтрации и очистки воды, в системах кондиционирования воздуха, подводных сооружениях.

Биопленка – это особая ниша, которая является чрезвычайно благоприятной средой для размножения микроорганизмов, так как формирующийся полисахаридный слой (гликокаликс) в совокупности с другими продуктами жизнедеятельности микроорганизмов, обеспечивающий бактериям защиту от неблагоприятных факторов окружающей среды в том числе химических и биологических.

Пресная вода является естественным местом обитания практически всех видов семейства Legionella-ceae. Причем легионеллы встречаются практически повсеместно [7].

Наиболее распространенный путь заражения – вдыхание человеком аэрозолей, контаминированных легионеллами. Точная доза бактерий, необходимая для инфицирования человека, неизвестна. Однако можно предположить, что она невелика, поскольку известны случаи заражения после крайне непродолжительной экспозиции, т.е. нахождении в зоне действия контаминированного легионеллами аэрозоля в течение нескольких минут, а также после экспозиции на довольно большой дистанции от источника заражения – до 6 км [9].

Тяжесть течения пневмонии, вызванной легионел-лами определяет особую важность проведения ее точной и своевременной лабораторной диагностики, кроме того данный возбудитель не растет на обычных питательных средах [10].

Существующие микробиологические методы диагностики обладают высокой стоимостью и длительны в исполнении (7-10 сут.).

Питательные среды являются основным звеном в системе микробиологических и биотехнологических исследований, своим качеством нередко определяя результаты исследования [2-4].

С целью удешевления питательных сред делаются попытки замены дорогостоящего мяса на субпродукты. Установлено, что легкое свиньи, относящееся к субпродуктам 2 категории, состоит в среднем из 13% белка. Биохимические исследования подтвердили, что в ферментативном гидролизате легкого свиньи (ФГЛс) отмечены наиболее оптимальные показатели аминокислотного состава, макро- и микроэлементы, витамины. Богатый состав подтверждает его биологическую полноценность, что является главным требованием к гидролизатам, используемым в качестве основы питательных сред [6].

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Нами использован ФГЛс как основа при разработке рецептуры новой питательной среды. В качестве исходной использовали рецептуру приготовления традиционной простой среды общего назначения – агара Хоттингера, в которой мясная основа была заменена на субпродукт. Такой подход, по нашему мнению, обеспечивает снижение себестоимости питательной среды при сохранении ее универсальности.

ФГЛс – белковая питательная основа является универсальным компонентом. Именно она обеспечивает биологическую полноценность и оптимальность развития культивируемых в ней организмов – легио-нелл.

На новой питательной среде изучали культуральные, морфологические свойства и подвижность, т.к. они являются важными и надежными диагностическими показателями для определения качества агари-зованной питательной среды.

Для бактериологического контроля питательных сред, предназначенных для диагностики легионеллеза, используют тест-штаммы Legionella pneumophila Philadelfia 1 ATCC 33152 и L. pneumophila Bloomington ATCC 33155. Указанные тест-штаммы получают из НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи.

Взвесь тест-штаммов засевают по 0,1 мл из разведения 10-7 (1.102 м.к./мл) на трех чашках Петри с питательной средой, распределяя посевной материал по поверхности среды методом покачивания чашек. Учет результатов производят визуально через 24-48-72 ч инкубации посевов при температуре (37±1) С.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

При выращивании тест-штаммов легионелл на питательной среде, приготовленной на основе ФГЛс, наблюдали рост свыше 50% плоско-выпуклых, синевато-сероватых, плоско-выпулых колоний размером 1,5-2,0 мм через 48 ч, тогда как на контрольной среде СЭЛ рост наблюдался только через 72 ч, на агаре Хоттингера роста не наблюдалось.

Таким образом, при получении результатов по испытанию новой питательной среды, следует подчеркнуть, что одновременное проявление культуральных и сохранение морфологических свойств, а также выраженной подвижности, свидетельствует о ее полноценности, а рекомендуемые подходы к разработке основы для конструирования новой питательной среды, позволили подтвердить эффективность применения в качестве дешевого, экономически целесообразного сырья легкого свиньи, а в качестве ростовых факторов – L-цистеин и эмбриональный стимулятор роста микроорганизмов, что открывает перспективы для его использования в микробиологической про- мышленности. Предложенная плотная питательная среда по чувствительности соответствует требованиям к питательным средам для выделения и культивирования возбудителя легионеллеза по биологическим показателям, а по скорости роста превосходит указанные требования, обеспечивая формирование колоний через 48±2 ч инкубации [4].

ВЫВОДЫ

Полученные результаты свидетельствуют, что опытная питательная среда плотная для культивирования и выращивания легионелл, приготовленная на ферментативном гидролизате легкого свиньи, имея более низкую, чем контрольная среда, стоимость, и обладая стандартностью, не уступает ей по изученным показателям. Проведенное исследование указывает на перспективность дальнейшей работы по внедрению питательной среды в микробиологическую практику с целью эффективного экологического мониторинга объектов внешней среды.