Регуляция лептином и грелином продукции интерферона и интерлейкина-4 в системе in vitro

Лептин и грелин являются пептидными гормонами, которые играют важную роль в регуляции репродуктивных процессов и иммунных реакций при беременности. Нарушение баланса этих гормонов сопряжено с дефектами репродуктивной функции вследствие срыва механизмов иммунологической толерантности [Tena-Sempere, 2007]. IFN- ° и IL-4 являются ключевыми цитокинами, продуцируемыми Т-хелперами (Th), и определяющими девиацию иммунного ответа по ТЫ или ТЬ2-типу [Ширшев, 2009]. Одним из наиболее важных механизмов формирования иммунологической толерантности при беременности является смещение акцента иммунных реакций по Т112-типу [Ширшев, 2009]. Поэтому изучение влияния лептина и грелина на продукцию IFN- °и IL-4 Т-лимфоцитами важно для понимания роли гормонов в Th-девиации при беременности.

Цель работы - изучить влияние лептина и грелина, а также их совместные эффекты в концентрациях, отражающих уровень гормонов в периферической крови при беременности, на синтез IFN- °и IL-4 в культуре мононуклеарных лейкоцитов, а также внутриклеточную продукцию вышеупомянутых цитокинов Т-лимфоцитами в системе in vitro.

Материалы и методы

Суспензию мононуклеарных лейкоцитов (МНЛ) периферической крови здоровых небеременных женщин репродуктивного возраста выделяли путем центрифугирования на градиенте плотности фикол-л-верографина. Полученную суспензию культивиро вали в полной питательной среде (среда 199 с добавлением 10 mM HEPES; 2 тМ L-глутамина; 100 мкг/мл гентамицина и 10% эмбриональной телячьей сыворотки) с гормонами при 37W в условиях 5% СО2 в течение суток. Лептин («Sigma», США) в культуры вносили в дозах 10 и 35 нг/мл, отражающих его содержание в периферической крови в I и во П-Ш триместрах беременности соответственно [Hardie, Trayhurn, 1997]. Грелин («Sigma», Израиль) использовали в концентрациях 1.25 и 0.83 нг/мл, соответствующих уровню гормона в периферической крови в I-II и III триместрах беременности [Fuglsang et al., 2005]. Для изучения совместных эффектов лептин и грелин вносили в культуры одномоментно в сочетаниях, характерных для I-II (лептин 10 нг/мл + грелин 1.2 нг/мл) и П-Ш (лептин 35 нг/мл + грелин 0.87 нг/мл) триместров беременности. Помимо гормонов в ряд культур вносили также липополисахарид (ЛПС, 100 нг/мл, «Sigma», США) и/или интерлейкин 2 (IL-2, 100 МЕ/мл, Россия). В контрольные пробы вместо гормонов добавляли равное количество их растворителя (изотонического хлорида натрия). После суточной инкубации в супернатантах культур оценивали концентрацию IFN- °и IL-4 методом ИФА с использованием коммерческих наборов «Вектор-Бест», согласно инструкции производителя.

Для активации внутриклеточного синтеза цитокинов в культуры добавляли форболмиристатацетат и иономицин, а также блокаторы внутриклеточного транспорта брефелдин А и моненсин (Cell Stimulation Cockteil and Protein Transport Inhibitors,

«eBioscience», США) в соответствии с методикой производителя.

Детекцию внутриклеточной выработки цитокинов Т-лимфоцитами проводили методом проточной цитометрии с использованием соответствующих моноклональных антител («eBioscience», США) к поверхностным (CD3) и внутриклеточным молекулам (IFN- ° IL-4) согласно методике производителя.

Достоверность полученных результатов оценивали по парному /-критерию Стьюдента.

Результаты и обсуждение

Показано, что лептин в исследуемых дозах усиливал продукцию IFN- ° но не влиял на выработку IL-4 интактными МНЛ, а также при добавлении ЛПС (табл. 1). Грелин, напротив, не оказывал статистически значимых эффектов на выработку IFN-° а в концентрации, сопоставимой с уровнем гор мона в I-II триместрах беременности, повышал уровень IL-4 только в культурах без ЛПС. При совместном внесении гормонов в дозах, характерных для I-II триместров беременности, выявлено снижение продукции IFN- ° в культурах без внесения ЛПС. Таким образом, можно полагать, что лептин при беременности проявляет провоспалительную активность, стимулируя выработку IFN- ° как на фоне исходного уровня активации клеток, так и при дополнительной активации ЛПС, что некоторым образом имитирует условия развития воспаления. Грелин, повышая выработку IL-4, оказывает противовоспалительное действие, которое, однако, отсутствует на фоне внесения ЛПС, что важно для понимания возможности использования гормона в терапевтических целях. Сочетанное действие лептина и грелина приводит к формированию новых кооперативных эффектов гормонов, отличных от их самостоятельных эффектов.

Таблица 1

Влияние лептина и грелина на синтез IFN- “и IL-4 в культуре МНЛ периферической крови (п = 5)

Экспериментальное воздействие	Концентрация цитокинов в супернатантах культур МНЛ, нг/мл
	без ЛПС		с ЛПС
	IFN- °	IL-4	IFN- °	IL-4
Контроль	44.2 + 21.8	5.14 + 0.78	24.4 ± 8.7	5.18 + 0.84
Лептин (10 нг/мл)	89.14 + 18.18	4.15 + 0.99	95.4 + 28.7*	6.12+1.22
Лептин (35 нг/мл)	99.04+ 15.35*	5.78 + 0.69	110.18 + 36.7*	6.78+1.01
Грелин (1.2 нг/мл)	50.14 + 28.18	7.09 + 0.92*	15.1+7.26	5.8 + 0.31
Грелин (0.87 нг/мл)	20.21 ± 14.0	5.68 + 1.05	13.8 + 5.52	5.35 + 0.96
Лептин + Грелин (10 нг/мл +1.2 нг/мл)	8.9 + 0.83*	5.42 + 1.04	10.65 + 8.06	4.94+1.15
Лептин + Грелин (35 нг/мл + 0.87 нг/мл)	17.6 + 5.08	5.31+0.68	29.2 + 22.9	4.98 + 1.2

Примечание. * - различия достоверны (р < 0.05) по парному t-критерию Стьюдента по отношению к контролю.

При культивировании клеток совместно с IL-2 лептин вне зависимости от дозы стимулирует выработку IFN- ° однако эти эффекты отсутствуют при внесении в культуру ЛПС (табл. 2). Возможно, это объясняется избыточной активацией клеток при совместном культивировании с IL-2 и ЛПС, так что на этом фоне лептин не оказывает значимых эффектов на продукцию IFN- ? Грелин, в концентрации, сопоставимой с уровнем гормона в I-II триместрах беременности, снижает продукцию IFN- °и не влияет на выработку IL-4. Тогда как при совместном внесении лептина и грелина на фоне IL-2 модулирующих эффектов гормонов на синтез IFN- °и IL-4 в культурах МНЛ не выявлено. Таким образом, активация клеток IL-2 меняет направленность эффектов гормонов на продукцию исследуемых цитокинов.

Таблица 2

Влияние лептина и грелина на синтез IFN- °и IL-4 в культуре МНЛ периферической крови на фоне активации IL-2 (п = 5)

Экспериментальное воздействие	Концентрация цитокинов в супернатантах культур МНЛ, нг/мл
	без ЛПС		с ЛПС
	IFN- °	IL-4	IFN- °	IL-4
Контроль	51.28+9.02	4.93+0.96	195.65+91.43	4.7+1.03
Лептин (10 нг/мл)	134.12+59.11*	7.85+1.84	358.1+125.2	5.58+1.15
Лептин (35 нг/мл)	151.32+44.02*	5.44+1.78	428.8+161.2	3.8+1.25
Грелин (1.2 нг/мл)	34.9+8.26*	4.8+0.86	252.1+116.39	5.28+0.98
Грелин (0.87 нг/мл)	59.32+13.04	4.6+1.05	120.5+51.2	5.75+1.28
Лептин + Грелин (10 нг/мл +1.2 нг/мл)	60.04+13.27	5.96+0.71	401.8+262.2	5.87+0.74
Лептин + Грелин (35 нг/мл + 0.87 нг/мл)	46.56+11.68	5.56+0.78	209.7+140.3	6.03+0.66

Примечание. * - различия достоверны (р < 0.05) по парному t-критерию Стьюдента по отношению к контролю.

Поскольку основными продуцентами IFN- °и IL- оценить влияние гормонов на внутриклеточный 4 являются Т-лимфоциты, представлялось важным синтез этих цитокинов CD3+- лимфоцитами.

Установлено, что грелин не влиял на процессы трансляции IFN- ? но стимулировал внутриклеточный синтез ILM CD3+- лимфоцитами (табл. 3). Лептин в исследуемых дозах не оказывал влияния на синтез изучаемых цитокинов Т-лимфоцитами. При совместном внесении гормонов выявлялся только стимулирующий эффект грелина в отношении синтеза ТЕМ СВЗ+-лимфоцитами.

Таблица 3

Влияние лептина и грелина на внутриклеточный синтез IFN- °и IL-4 Т-лимфоцитами периферической крови (п = 6)

Экспериментальное воздействие	Процентное содержание Т-лимфоцитов, продуцирующих IFN- °или IL-4
	CD3TN- 4	CD3+IL-4+
Контроль	3.05W.07	2.86 9^.58
Лептин (10 нг/мл)	4.13^.65	3.75^.97
Лептин (35 нг/мл)	2.77^.76	4.16W.86
Грелин (1.2 нг/мл)	4.56^.92	5.21W.77*
Грелин (0.87 нг/мл)	5.42^.56	<9^.94*
Лептин + Грелин (10 нг/мл +1.2 нг/мл)	5.382^.48	6.992^.5*
Лептин + Грелин (35 нг/мл + 0.87 нг/мл)	4.51^.65	5.68W.46*

Примечание. * - различия достоверны (р < 0.05) по парному t-критерию Стьюдента по отношению к контролю.

Анализируя механизмы действия гормонов, можно полагать, что поскольку стимулирующий эффект лептина на продукцию IFN- “выявлен только в культуре МН Л. возможно, что действие гормона опосредовано через моноциты, взаимодействие лимфоцитов с которыми и приводит к усилению выработки IFN- ? Грелин. напротив, в концентрациях. характерных для беременности, по-види-мому. путем непосредственного взаимодействия с Т-лимфоцитами, усиливает процессы трансляции IL-4 CD3+- лимфоцитами периферической крови. Причем этот эффект превалирует при сочетанном внесении гормонов в культуры лимфоцитов, но не мононуклеаров. Из чего следует, что присутствие моноцитов влияет на эффекты грелина на лимфоциты. Возможно, что грелин преимущественно будет связываться с моноцитами, поскольку, по данным литературы, именно моноциты обладают наибольшей плотностью рецепторов к лептину и гре-лину, повышающейся при активации клеток [Dixit et aL 2003; 2004].

Суммируя полученные результаты, можно полагать. что лептин и грелин. которые являются разнонаправленными регуляторами энергетического обмена и оказывают оппозитные эффекты на направленность иммунных реакций, в концентрациях. характерных для беременности, при сочетанном внесении выступают факторами, способствующими смещению иммунных реакций по Т112-типу и поддержанию иммунологической толерантности.

Впервые показано, что при совместном внесении гормонов реализуются только эффекты грели на. стимулирующий синтез ИЛ-4, и оказывающий фетопротективный эффект.

Работа поддержана программой фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» 12-П-4-1017