Состав микробиоты кишечника при длительных занятиях тхэквондо в детском возрасте

А.В. Кабачкова1,2, , В.А. Шепилова1,2, , О.П. Иккерт1, ,

A.V. Kabachkova1,2, , V.A. Shepilova1,2, , O.P. Ikkert1, ,

Введение. Микробиота кишечника состоит из множества разнообразных микроорганизмов (бактерии, грибы и археи). Каждый из нас обладает своей уникальной микробиотой, такой же неповторимой, как, например, отпечатки пальцев. В настоящее время уже не подвергается сомнению её роль в поддержании здоровья человека [5, 7]. Эффекты взаимодействия микробиоты и желудочно-кишечного тракта наблюдаются не только локально, но и в отдаленных органах благодаря системному распределению веществ и клеток. Это явление получило название «ось кишечник – орган» [4]. Миллионы лет происходила совместная эволюция, которая привела к взаим- ному симбиозу между микробиотой и организмом-хозяином, благодаря чему сформировались сложные оси отношений [8]. Огромное количество работ в этой области посвящено изучению микробиоты при различных патологических изменениях в организме, в то время как особенности здоровой микробиоты остаются малоизученными. Все больше исследователей начинает интересовать поиск возможных терапевтических методов воздействия на микробиоту с целью модулирования её состояния [9, 11]. И если фармакологические и диетические вмешательства уже давно являются центральным звеном многих работ, то научный интерес к изучению влияния фи- зических нагрузок только набирает силу [13, 15, 20]. Имеющиеся данные пока дают лишь первоначальное представление о том, каким образом физическая активность может влиять на микробное разнообразие кишечника [18]. Появляющиеся немногочисленные работы в этой области пока не раскрывают точные механизмы, лежащие в основе влияния физических упражнений на микробиоту и не дают четких представлений о составе здоровой микробиоты кишечника [3, 19]. Регистрация большего микробного разнообразия у физически активных людей, по сравнению с людьми, ведущими малоподвижный образ жизни является пока единственным общим показателем изменений микробиоты под влиянием физических нагрузок в данных исследованиях [6]. На уровне определенных родов или семейств бактерий наблюдается весьма неоднородная картина, что свидетельствует о недостаточности накопленных данных. Стоит отметить, что практически нет данных о влиянии физических нагрузок на кишечный микробиом детей [1]. Хотя именно в детский период наблюдается активная колонизация микроорганизмами и окончательное формирование микробиоты [17]. Например, потребление в детском возрасте избыточного количества жирной и высокоуг-леводной пищи в совокупности с гиподинамией может привести к её необратимым нарушениям [2]. Поэтому модуляция микробиоты с помощью физической активности предстает крайне интересной и перспективной темой для дальнейших исследований.

Цель исследования: изучить качественный и количественный состав микробиоты кишечника детей младшего школьного возраста с разным уровнем физической активности.

Материалы и методы. Дизайн исследования и участники. В исследовании приняли участие три группы условно здоровых детей, каждая из которых состояла из 12 волонтеров с равномерным распределением по полу и возрасту без симптомов острых вирусных и/или бактериальных заболеваний. Возраст детей варьировался от 8 до 10 лет. Первая группа состояла из детей, которые не занимались дополнительными физическими нагрузками, кроме обязательных занятий по физической культуре в школе (контрольная группа или К). Вторая группа включала детей, которые начали дополнительно посещать секцию боевых искусств (тхэквондо) от трёх до шести месяцев (группа начинающих спортсменов или

НС). Третья группа включала детей, которые дополнительно регулярно посещали секцию боевых искусств (тхэквондо) более двух лет (группа спортсменов или С). Уроки физкультуры в школе проводились два раза в неделю, а занятия боевыми искусствами – 2–3 раза в неделю. Группы были однородны по полу, возрасту и антропометрическим параметрам и не имели симптомов острых вирусных или бактериальных инфекций на момент сбора образцов кала. Никто из участников не принимал антибиотики, пробиотики или пребиотики в течение двух месяцев до начала исследования. Для всех детей был характерен схожий рацион питания: завтрак, обед, полдник и ужин, а также имели примерно одинаковое время приема пищи. Кроме того, все получали полноценный ночной сон продолжительностью 8–9 часов в школьные дни и до 10 часов в выходные дни.

Исследование было одобрено комитетом по биоэтике Биологического института и экспертной комиссией по рассмотрению материалов, предназначенных для открытой публикации национального исследовательского Томского государственного университета. Информированные согласия были получены заранее от всех родителей или законных представителей.

Сбор образцов и извлечение ДНК. Сбор образцов кала был проведен в г. Томске (Россия) в весенний период (апрель – май 2024 г.). Пробы собирали в утреннее время в стерильные пластиковые контейнеры объемом 50 мл и временно хранили при температуре 2–4 °C не более четырех часов до момента транспортировки в лабораторию. В лабораторных условиях образцы немедленно были аликвотирова-ны в заранее промаркированные криопробирки и заморожены при –80 °C для последующей экстракции ДНК.

Выделение тотальной геномной ДНК выполняли с использованием набора MagPure Stool DNA LQ Kit (Magen, Китай) в строгом соответствии с протоколом производителя. Концентрацию и чистоту полученных препаратов ДНК оценивали на спектрофотометре NanoPhotometer® NP80 Tech Specs (Implen GmbH, Германия). Все образцы ДНК были доставлены в замороженном состоянии для проведения секвенирования в лабораторию «Геномед» (Медико-генетический центр, лаборатория молекулярной патологии, Москва, Россия).

Секвенирование ампликонов и биоинфор-матический анализ . Секвенирование библиотеки ампликонов проводили на платформе PromethION/MinION (Oxford Nanopore Technology). Образцы подвергались ферментативной очистке и контролю качества перед секвенированием. Гипервариабельный участок гена 16s рРНК V1–V9 амплифицировали методом полимеразной цепной реакции и сек-венировали.

Оценка качества каждого образца проводилась с помощью FastQC v0.12.0, а агрегированные результаты визуализировались с помощью MultiQC v1.29. Последовательности адаптеров удалялись с помощью Porechop v0.2.4, инструмента, разработанного для работы с данными Oxford Nanopore. Чтения длиной от 1300 до 1900 пар оснований сохранялись для дальнейшего анализа с помощью SeqKit v2.10.0, а дополнительная фильтрация проводилась с помощью Fastp v1.0.1. Выравнивание прочтений проводилось с помощью Minimap2 по базе данных, включающей записи из NCBI 16S RefSeq и rrnDB. Таксономическая классификация проводилась с помощью Emu 10. Чтобы снизить влияние редких таксонов и потенциальных артефактов, виды с относительной численностью ниже 0,1 % были исключены из результатов.

Все данные секвенирования были представлены в архиве прочтений последовательностей NCBI (SRA) под регистрационным номером BioProject PRJNA1195688.

Результаты. Представленность филумов в наблюдаемых группах. Термином «филум» в классификации прокариот обозначается тип микроорганизмов. Нормальная микробиота представлена широким спектром микроорганизмов, которые в основном являются представителями пяти филумов. Это два доминирующих – Firmicutes и Bacteroidetes, которые составляют более 90 % всего сообщества, а также другие субдоминантные филумы – Proteobacteria, Actinobacteria и Verrucomic-robia [16]. Соотношение доминирующих фи-лумов Firmicutes / Bacteroidetes принято рассматривать как потенциальный маркер состояния кишечника. Но в настоящее время накоплены противоречивые данные об этом соотношении, что не позволяет признать этот параметр как надежный критерий дисбиоза особенно при ожирении [12]. Несмотря на это, высказано предположение, что Firmicutes более эффективно извлекают энергию из пищи, чем Bacteroidetes, способствуя тем самым более качественному усвоению калорий [10]. В нашем исследовании наблюдается увеличение этого соотношения в 1,5 раза: в группе спортсменов – 8,3, против 5,7–5,8 в остальных группах (контрольная группа и группа начинающих спортсменов). Эти результаты согласуются с данными метаанализа (25 исследований с общим числом участников 1044 человека), который демонстрирует уменьшение количества Bacteroidetes и увеличение Firmi-cutes при физических нагрузках у взрослых [14].

При сравнении относительной распространенности всех филумов можно увидеть определенную тенденцию их соотношения у детей, длительно занимающихся дополнительной физической активностью (группа спортсменов) по сравнению с контрольной группой и группой начинающих спортсменов (обе – 80 % Firmicutes, 0,6 % Actinobacteria и 14 % Bacteroidetes) – относительное увеличение филума Firmicutes до 83 % на фоне снижения филумов Actinobacteria до 0,2 % и Bacte-roidetes до 10 %. Что касается количественного состава, то в группе спортсменов у большинства отмечается смещение в сторону 4–5 филу-мов (Actinobacteria, Firmicutes, Bacteroidetes, Proteobacteria и Verrucomicrobia – 83 % (10/12), в то время как у остальных встречаются от 3 до 7.

При сравнении представительств филу-мов наблюдаются определенные тенденции в наличии и отсутствии некоторых из них в наблюдаемых группах (табл. 1), что может отражать влияние физической активности на изменение состава микробиоты кишечника в зависимости от длительности занятий. В группе детей, которые только начали заниматься дополнительно в секции боевых искусств (группа начинающих спортсменов), наблюдаются изменения в разнообразии филумов, в том числе увеличение Proteobacteria более чем в два раза, что может быть связано с адаптацией к новым условиям – регулярные дополнительные физические нагрузки, которые являются еще крайне стрессорными для организма.

В группе спортсменов наблюдается увеличение Firmicutes на 4 % и почти троекратное увеличение относительного числа Ver-rucomicrobia, что может указывать на активизацию метаболических процессов. Также в работе Fei Zhong et al. (2021) показано, что физические упражнения могут увеличивать

Таблица 1

Table 1

Группа наблюдения / Observation group
К / C		НС / NA			С / A
Firmicutes	79,78	Firmicutes		79,27	Firmicutes	↑		83,00
Actinobacteria	0,61	Actinobacteria		0,58	Actinobacteria			0,24
Bacteroidetes	14,07	Bacteroidetes		13,62	Bacteroidetes			9,90
Fusobacteria	0,04
Proteobacteria	1,12	Proteobacteria	↑↑	2,51	Proteobacteria	↓		0,82
Verrucomicrobia	0,86	Verrucomicrobia	↓↓	0,45	Verrucomicrobia	↑↑		2,57
Synergistetes	0,01				Synergistetes			0,02
		Tenericutes		0,02
		Lentisphaerae		0,06
		Elusimicrobia		0,26
Остальные / Others	3,50	Остальные / Others		3,25	Остальные / Others			3,45
Условная норма / Reference profiles
Тип микробиоты со склонностью к дисбиозу Type of microbiota prone to dysbiosis		Переходный тип микробиоты Transitional type of microbiota			Устойчивый тип микробиоты Stable type of microbiota

Представленность филумов (в %) в наблюдаемых группах

Representation of phyla (in %) in the observed groups

Примечание. К – контрольная группа, НС – группа начинающих спортсменов, С – группа спортсменов; голубым цветом обозначено сходство филумов; ↑ – относительное увеличение числа представителей филума по сравнению с контрольной группой, в том числе ↑↑ – увеличение более чем в два раза; ↓ – относительное снижение числа представителей филума по сравнению с контрольной группой, в том числе ↓↓ – снижение практически в два раза; зеленым цветом обозначены благоприятные адаптивные эффекты физических нагрузок на состав микробиоты, усиливающие её противовоспалительные свойства.

Note . C – control group, NA – novice athlete group, A – athlete group; blue color indicates phylum similarity; ↑ – relative increase in the number of phylum representatives compared to the control group, including ↑↑ – more than a twofold increase; ↓ – relative decrease in the number of phylum representatives compared to the control group, including ↓↓ – almost a twofold decrease; green color indicates the beneficial adaptive effects of physical exercise on the composition of the microbiota, enhancing its anti-inflammatory properties.

численность бактерий, связанных с противовоспалительным действием, таких как Verru-comicrobia, и уменьшать численность бактерий, связанных с провоспалительным действием, таких как Proteobacteria [21]. Аналогичные эффекты наблюдаются в нашем исследовании в группе спортсменов (см. табл. 1), микробиота которых по совокупности представленных микроорганизмов характеризуется выраженными противовоспалительными свойствами. В то же время в группе начинающих спортсменов уже присутствуют адаптивные перестройки микробиоты, хотя и отмечаются её относительно повышенные провоспалитель-ные свойства. В целом во всех наблюдаемых группах состав микробиоты отражает некоторую условную норму, но каждая из групп характеризуется особенностями по представленности филумов. Это позволило нам предположить наличие разных типов микробиоты, которые формируются под влиянием такого модулирующего внешнего фактора, как наличие регулярной физической активности. В контрольной группе мы наблюдаем (1) относительно нормальную микробиоту, но склонную к дисбиозу (например, при несбалансированной диете). В группе начинающих спортсменов – (2) переходный тип микробиоты, отражающий начавшиеся адаптивные перестройки в ответ на появление дополнительных регулярных физических нагрузок. А в группе спортсменов – (3) устойчивый тип микробиоты, отражающий адаптацию к регулярным и длительным физическим нагрузкам.

Родовая принадлежность микроорганизмов в наблюдаемых группах. Следующим этапом была оценка родовой принадлежности микроорганизмов. У детей контрольной группы два рода (всего – 91) доминируют – Faecali-bacterium (27,86 %) и Bacteroides (9,49 %), что

Таблица 2

Table 2

Относительная выборочная представленность родов микроорганизмов (в %) в наблюдаемых группах

Relative selective representation of microorganism genera (in %) in the observed groups

%	Группа наблюдения / Observation group
	К / C		НС / NA		С / A
≥ 5 %	Faecalibacterium	27,86	Faecalibacterium	24,62	Faecalibacterium		23,42
	Bacteroides	9,49	Bacteroides	6,88	Roseburia		8,68
			Eubacterium	6,18		Gemmiger	7,74
			Gemmiger	6,01	Akkermansia		6,34
					Eubacterium		5,52
%	2 % (2/91)		5 % (4/89)		6 % (5/91)
≥ 4 %	Eubacterium	4,84	Massiliprevotella	4,30			1
%	1 % (1/91)		1 % (1/89)		0 % (0/91)
≥ 3 %	Roseburia	3,43	Roseburia	3,59	Lachnospira		3,75
	Prevotella	3,34	Dialister	3,07	Phocaeicola		3,01
	Gemmiger	3,08	Lachnospira	3,01
%	3 % (3/91)		3 % (3/89)		2 % (2/91)
≥ 2 %	Phocaeicola	2,63	Others	2,48	Others		2,83
	Faecalicatena	2,59	Prevotella	2,36	Bacteroides		2,40
	Others	2,44	Neglecta	2,11	Prevotella		2,11
	Oscillibacter	2,23			Oscillibacter		2,10
					Neglecta		2,02
%	4 % (4/91)		3 % (3/89)		6 % (5/91)
≥ 1 %	12 % (11/91)		11 % (10/89)		6 % (5/91)
<1 %	78 % (70/91)		77 % (68/89)		81 % (74/91)

Примечание . К – контрольная группа, НС – группа начинающих спортсменов, С – группа спортсменов; цветом обозначены некоторые рода для визуализации увеличения или уменьшения их относительного представительства в наблюдаемых группах.

Note . C – control group, NA – novice athlete group, A – athlete group; some genera are marked in color to visualize the increase or decrease of their relative representation in the observed groups.

в целом отражает наличие здоровой и стабильной микробиоты с базовыми противовоспалительными свойствами. Остальные рода представлены в объеме менее 5 %, причем 78 % (70/91) имеют относительную распространенность менее 1 % (табл. 2). Разнообразие других видов также подчеркивает их потенциальные преимущества для поддержания здоровья кишечника.

В группе начинающих спортсменов наблюдается снижение некоторых таксонов, однако такое снижение происходит на фоне увеличения других, что может свидетельствовать о метаболических изменениях, связанных с дополнительной физической активностью. Также стоит отметить большое разнообразие родов в этой группе детей – 89. В целом у детей этой группы доминируют четыре рода – Faecalibacterium (24,62 %) и практически в равной степени Bacteroides (6,88 %), Eubac- terium (6,18 %) и Gemmiger (6,01 %). Остальные рода представлены в объеме менее 5 %, причем 77 % (68/89) имеют относительную распространенность менее 1 % (см. табл. 2).

В группе спортсменов общее количество родов значимо не отличается от других групп наблюдения – 91, но отличается качественный состав. В частности, у детей этой группы доминирует уже пять родов – Faecalibacterium (23,42 %), Roseburia (8,68 %), Gemmiger (7,74 %), Akkermansia (6,34 %) и Eubacterium (5,52 %). При этом численность Bacteroides снизилась до 2,40 % (практически в 4 и 3 раза в сравнении с контрольной группой и группой начинающих спортсменов соответственно). Вероятно, преобладающие роды микроорганизмов могут указывать на более активные метаболические процессы и адаптацию к длительным и регулярным физическим нагрузкам. Остальные рода представлены в объеме менее 5 %, причем 81 % (74/91) имеют относительную распространенность менее 1 % (см. табл. 2).

Во всех группах доминирующим родом остается Faecalibacterium (см. табл. 2), хотя и отмечается его постепенное относительное снижение при наличии дополнительных систематических физических нагрузок. В группе начинающих спортсменов возрастает численное представительство Eubacterium и Gem-miger до 6 %, при этом снижается относительная численность Bacteroides на ≈ 2,5 %. В группе спортсменов качественно меняется состав доминирующих родов, помимо Eubacterium и Gemmiger появляются Roseburia и Akker-mansia . Таким образом, наблюдается явная связь между уровнем физической активности и составом микробиоты. Здоровые дети, не занимающиеся дополнительной физической активностью, имеют нормальную кишечную микробиоту. Однако с началом дополнительных занятий происходит изменение в её составе, что может отражать адаптацию к новым условиям. У детей, которые занимаются длительно, наблюдается более разнообразный состав микробиоты, а также отмечается увеличения числа микроорганизмов участвующих в метаболических процессах.

Заключение. Результаты различных исследований демонстрируют двустороннюю связь между физическими упражнениями и составом микробиоты кишечника. Регулярная физическая активность отражается на микробном составе кишечника, увеличивая его биоразнообразие, повышая уровни популяций бактерий, участвующих в энергетическом обмене и в утилизации водорода, тем самым косвенно повышая уровень адаптации организма-хозяина к физическим нагрузкам. При этом состав и метаболическая активность кишечной микробиоты могут способствовать не только улучшению переваривания пищи, но и аккумулированию энергии у людей с высоким уровнем физической активности. Это происходит путем прямого влияния метаболитов, которые выделяют микроорганизмы, на липо-генез, глюконеогенез и экспрессию генов, связанных с термогенезом. Данное исследование продемонстрировало значительное влияние физической активности на качественный и количественный состав микробиоты у детей младшего школьного возраста. В частности, длительные регулярные занятия тхэквондо приводят к адаптационным перестройкам микробного сообщества, которое выражается в снижении доли Faecalibacterium и Bacte-roides, а также в увеличении доли Eubac-terium, Gemmiger, Roseburia и Akkermansia. Такие изменения можно рассматривать как положительную адаптацию микробиоты, способствующую улучшению метаболического здоровья и целостности кишечного барьера в условиях регулярных интенсивных физических нагрузок.