Влияние циклодекстриновых комплексов с хитозаном и левофлоксацином на микрофлору ран и толстого кишечника сомов

Введение. В аквакультуре при разведении и выращивании рыбы часто приходится сталкиваться с нарушением целостности и инфицированием ее кожных покровов при перевозке, сортировке, уплотненной посадке. С целью лечения и профилактики применяют антибиотики, которые вводят в организм рыб с помощью лечебных ванн, инъекций или с кормами перорально [1, 2].

В последнее время с развитием нанотехнологий для точной доставки лекарственных средств в организм животных стали использовать раз- личные наночастицы. Одной из таких новейших разработок являются комплексы производных β-циклодекстринов (ЦД) [3–11]. Производные β-циклодекстринов вследствие крошечного размера и пористой природы могут связывать малорастворимые препараты в пределах их матрицы и повышать их растворимость, стабильность и биодоступность [2, 3]. Но при этом необходимо учитывать, что сочетание циклодекстриновых носителей с различными полимерами с большим количеством ковалентных внутримолекулярных связей может обуславливать изменение свойств препарата по сравнению с простым комплексом лекарство-ЦД [12, 13].

Одним из возможных компонентов такого комплекса выступает гетерополисахарид хитозан, характеризующийся хорошей водораство-римостью, биосовместимостью и биоразлагаемостью, мукоадгезией, антимикробной активностью [14–17]. Все эти свойства хитозана делают его привлекательным для применения в сельском хозяйстве и ветеринарии. В связи с этим научные изыскания по созданию и повышению эффективности таких циклодекстриновых лекарственных комплексов с антибиотиками в терапии промысловых рыб являются актуальными.

В качестве антиотибиотиков, помещающихся в пористой структуре комплексов производных в-циклодекстринов, могут выступать фторхино-лоны II поколения, действующие против инфекций различных этиологий [13, 18], в том числе возбудителей инфекционных поражений резаных, ожоговых и других видов ранений и повреждений наружных покровов.

В отечественной аквакультуре широко применяется ципрофлоксацин, в свою очередь левофлоксацин, также относящийся к фторхино-лонам, является новым, недостаточно изученным средством для лечения рыб, но перспективным, поскольку резистентность к применяемым в аквакультуре антибиотикам у рыб - достаточно распространенное явление [19-21].

Цель исследования - изучение влияния комплексов хитозан-в-циклодекстрин с иммобилизованным левофлоксацином на некоторые микробиологические показатели резаных ран и толстого кишечника сомов.

Задачи: определить влияние комплексов хи-тозан-В-циклодекстрин, содержащих 10, 15 или 20 % левофлоксацина, на общее микробное число (ОМЧ) резаных ран, общее микробное число и количество молочнокислых бактерий толстого кишечника сеголеток африканского лабиринтового сома в динамике.

Объекты и методы. Эксперимент проводился в научно-исследовательской лаборатории «Прогрессивные биотехнологии в аквакультуре» ФГБОУ ВО «Вавиловский университет» в условиях аквариумной установки. Влияние комплек- сов в-циклодекстринов с разной концентрацией левофлоксацина на течение инфекционного процесса и заживление резаных ран рыб исследовали на сеголетках африканского лабиринтового сома - Clarias gariepinus (Burchell, 1822). Согласно принципам рациональной антибиоти-котерапии и для поиска наименьшей эффективной концентрации в работе использовались комплексы с разным содержанием антибиотика. Исследуемые комплексы в-циклодекстринов были синтезированы на кафедре «Химическая энзимология» МГУ им. М.В. Ломоносова и представляли собой порошок светло-желтого цвета, добавляемый в корм рыбам.

Для проведения исследований методом параналогов были сформированы 5 групп сомов (n = 10), размещенные в аквариумах: 1-я контрольная (К1), в которой рыбы получали сбалансированный корм (ОР); 2-я контрольная (К2) с модельным нарушением пищеварения и дис-биозом кишечника за счет приема корма с перекисным числом 24,68 ± 2,22 (ОРН); 1-я опытная, в которой рыбы получали качественный сбалансированный корм по питательным веществам с добавлением циклодекстринового комплекса с 20 %-м содержанием антибиотика; 2-я опытная, рыбы которой также получали качественный сбалансированный корм с добавлением циклодекстринового комплекса с 15 %-м содержанием антибиотика, и 3-я опытная группы, где для лечения применялись комплексы с 10 %-м содержанием левофлоксацина.

Сомов содержали в аквариумах объемом 250 л; температура воды - 26,0-27,0 °С; уровень растворенного в воде кислорода - 7,0 мг/л; рН - 7,8; прозрачность воды - 45,0-50,0 см; частота замены воды в аквариуме - 250 л в сутки. Гидрохимический режим был одинаков во всех группах и являлся оптимальным для выращивания сомов. Продолжительность эксперимента составила 14 дней. Корм с циклодекстриновым лекарственным комплексом рыбы получали ежедневно три раза в день. Особи контрольных групп (К1 и К2) изучаемые комплексы не получали, рыбы 2-й контрольной группы в течение всего опыта продолжали получать некачественный корм. Исследование проводили по схеме, представленной в таблице 1.

Таблица 1

The scheme of experience

Группа	Состояние кожного покрова рыбы	Тип кормления
К1	Повреждена	Основной рацион качественный корм (ОР)
К2	Повреждена	Основной рацион некачественный корм (ОРН)
1-я опытная	Повреждена и получает лечение	ОР + комплекс с 20 % левофлоксацина
2-я опытная	Повреждена и получает лечение	ОР + комплекс с 15 % левофлоксацина
3-я опытная	Повреждена и получает лечение	ОР + комплекс с 10 % левофлоксацина

Таблица 2

Влияние комплекса хитозан-ß-циклодекстрин с левофлоксацином на микрофлору резаных ран сомов (M±m)

The effect of the chitosan-ß-cyclodextrin complex with levofloxacin on the microflora of cut wounds of catfish (M±m)

Группа	ОМЧ, КОЕ/мл
	Сутки
	1-е	8-е	14-е
К1	1,0∙104±0,4	1,0∙104±0,4	1,0∙104±0,4
К2	3,0∙104±0,8	1,0∙104±0,4•	1,0∙105±0,8*■•
1-я опытная	1,0∙104±0,4	1,0∙103±0,4*• ˚	1,0∙103±0,4*■• ˚
2-я опытная	1,0∙104±0,4	1,0∙103±0,4*• ˚ ▲	1,0∙103±0,4*■ • ˚
3-я опытная	1,0∙104±0,4	1,0∙104±0,4▲◊	1,0∙103±0,4*■• ˚

Примечание : р ≤ 0,05 относительно *значения 1-х сут в своей группе; ^■ значения 8-х сут в своей группе; ^• относительно значения в группе К1 в эти же сутки; ˚ относительно значения в группе К2 в эти же сутки; ^▲ значения в 1-й опытной группе в эти же сутки; ^◊ значения во 2-й опытной группе в эти же сутки.

В смывах с ран рыб контрольных групп количество микроорганизмов вплоть до 14-го дня наблюдения не снижалось (К1) и даже возрастало (К2), что свидетельствует о продолжении и развитии инфекционного процесса. К окончанию эксперимента ОМЧ во второй контрольной группе было в 10 раз больше по сравнению с таковым 1-й контрольной, что подтверждает влияние качества корма на рост и развитие микрофлоры ран рыб.

Количество микрофлоры в ранах опытных групп в 1-е сут было сопоставимо с ее числом в обеих контрольных группах, поскольку условия моделирования ран для всех рыб были идентичны, а исследуемые препараты не успели оказать лечебного воздействия.

Эффективное подавление микрофлоры ран, в т. ч. условно-патогенной, к 8-м сут наблюдали в опытных группах с 20 и 15 %-м содержанием антибиотика - в 10 раз по сравнению с 1-ми сут. Эта тенденция сохранялась к концу экспери-

мента к 14-м сут. У рыб третьей опытной группы, получавших минимальную концентрацию фторхинолона, уровень ОМЧ на 8-е сут был сопоставим с результатами в группах К1 и К2, а на 14-е сут - различий с 1-й и 2-й опытными группами не было. Известно, что в составе микрофлоры воды преобладают бактерии родов Pseudomonas , Aeromonas , Flavobacterium , Proteus , Bacillus и семейства Enterobacteriacea [24]. Эти представители условно-патогенной микрофлоры участвуют в развитии инфекционного процесса при нарушении целостности кожного покрова у различных сельскохозяйственных животных [25–29], очевидно, что они же участвуют в развитии воспаления у гидробионтов, а общая плотность бактерий влияет на скорость заживления.

Результаты исследования кишечной микрофлоры сомов при применении для заживления ран комплексов с левофлоксацином представлены в таблице 3.

Таблица 3

Влияние комплекса хитозан-ß-циклодекстрин с левофлоксацином на микрофлору толстого кишечника сомов (M ± m)

The effect of chitosan-ß-cyclodextrin complex with levofloxacin on the microflora of the large intestine of catfish (M ± m)

Группа	ОМЧ, КОЕ/г	Молочнокислые бактерии, КОЕ/г	ОМЧ, КОЕ/г	Молочнокислые бактерии, КОЕ/г	ОМЧ, КОЕ/г	Молочнокислые бактерии, КОЕ/г
	Сутки
	1-е		8-е		14-е
К1 (хор)	1Д106±0,4	1Д102±0,4	1,0^106±0,5	1,0'103±0,3 ^	1Д106±0,4	1>104±03
К2(плох)	—	—	1,0-107±0,3 •*	1Д102±0,1 *	1,0^107±0,8 •*	1Д102±0,2 *
1-я опытная	—	—	1,0-10 5 ±0,3 • * ▲	1Д102±0,1 *	1Д104±0,1 •*▲	1Д103±0,8 •▲
2-я опытная	—	—	1,0-10 5 ±0, • * ▲	1Д102±0,1 *	3,0^105±0,4 • * ▲	1,0^104±0,1 •▲
3-я опытная	—	—	1Д106±0,3 ▲ • ◊	1Д103±0,1 •*▲◊	1,0-10 5 ±0,4 • * ▲	1Д104±0,4 * •▲ • ◊

Примечание : р < 0,05 относительно • значения 1-х сут в группе К1; *относительно значения в группе К1 в эти же сутки; ▲ относительно значения в группе К2 в эти же сутки; ° значения в 1-й опытной группе в эти же сутки; ◊ значения во 2-й опытной группе в эти же сутки; «-» исследование не проводилось.

При исследовании кишечной микрофлоры тва микроорганизмов от концентрации антибиосомов наблюдали прямую зависимость количес- тика. В 1-й и 2-й опытных группах, получавших

20 и 15 % дозу антибиотика, уже к 8-м сут ОМЧ толстого кишечника было в 10 раз ниже контрольной группы К1, питавшейся качественным кормом. Количество молочнокислых бактерий в этих группах было в 10 раз ниже относительно К1 и аналогично К2, что объясняется антимикробным действием лекарственного препарата. У рыб 3-й опытной группы, получавших комплекс с 10 %-м содержанием антибиотика, результат при подсчете ОМЧ и молочнокислых бактерий был аналогичен результату во 2-й контрольной группе, питавшейся некачественным кормом.

В конце исследования наибольшую подавляющую активность проявил образец с наибольшим содержанием левофлоксацина. Во 2-й и 3-й опытных группах спустя 14 сут применения циклодекстриновых комплексов общее количество микроорганизмов и количество молочнокислых бактерий среди них одинаково, а относительно 1-й опытной группы выше в 10 раз. В контрольных группах без лечения ОМЧ было значительно выше опытных, при этом доля полезных молочнокислых бактерий среди них ниже, чем в опытных, что также свидетельствует о влиянии рациона питания рыб и качества корма на нормофлору кишечника при заболеваниях, сопровождающихся инфекционным процессом, в т. ч. повреждения кожи.

Сравнительный анализ количества молочнокислых бактерий в опытных группах в конце исследования показал, что доля молочнокислых бактерий в ОМЧ выше исходных данных, полученных при моделировании нарушения пищеварения, что свидетельствует об эффективности применения комплексов не только для заживления ран, но и для восстановления состава микрофлоры при дисбиозах.

Заключение. При исследовании эффективности комплексов хитозан-β-циклодекстрин с левофлоксацином в отношении микрофлоры, населяющей раны покровов и кишечник сомов, установлено их значительное участие в заживлении ран рыб. Об этом свидетельствует уменьшение ОМЧ ран и кишечника рыб к концу эксперимента во всех опытных группах с лечением по сравнению с контрольными. Результаты исследования показали, что все комплексы хитозан-β-циклодекстрин с различным содержанием левофлоксацина эффективны в отношении микрофлоры резаных ран сомов. В отношении кишечной микрофлоры наибольшую подавляющую активность на конец исследования проявил образец с 20 %-м содержанием левофлоксацина. Доля молочнокислых бактерий в ОМЧ в опытных группах в конце исследования возросла относительно начала применения лечебных комплексов, что свидетельствует об эффективности применения комплексов не только для заживления ран, но и для восстановления состава микрофлоры при дисбиозах. Лечебное действие комплексов усиливалось применением качественного корма, поскольку количество молочнокислых бактерий в 1-й контрольной группе, питавшейся также качественным кормом, было сопоставимо с опытными группами. В 1-й контрольной группе ОМЧ в 10 раз был выше опытных, что свидетельствует о подавляющем влиянии лечебных препаратов на нормофлору кишечника. Результаты исследования в перспективе применимы для лечения и профилактики инфекционных заболеваний при выращивании рыб.