Влияние фенольных и полисахаридных соединений растительного происхождения на состояние иммунной системы организма при экспериментальной иммунодепрессии

В связи с широким распространением иммунодефицитных состояний актуален поиск новых эффективных иммуномодуляторов, обладающих мягким действием и способных воздействовать только на измененные звенья иммунной системы. Усилия большого количества ученых во всем мире направлены на поиск соединений, которые могли бы стать эффективными лигандами рецепторов иммунокомпетентных клеток с целью специфической и неспецифической стимуляции функций данных клеток при иммунодефицитных состояниях.

В последние годы внимание многих исследователей привлекают работы по изучению иммуно-тропных свойств фенольных соединений и полисахаридов растительного происхождения, не имеющих побочных эффектов и характеризующихся низкой токсичностью, что дает им значительные преимущества при разработке иммуномодулирующих средств [1, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 11, 12, 13].

Целью настоящего исследования явилось определение иммуномодулирующего действия фенольных и полисахаридных соединений, выделенных из лекарственных растений, при экспериментальной аза-тиоприновой иммунодепрессии.

Материалы и методы

Эксперименты проведены на мышах-самцах линий СВА и F1 (СВАхС57Вl/6) массой 18-20 г. Действие исследуемых веществ на показатели клеточного и гуморального звеньев иммунитета было изучено на животных, находящихся в состоянии иммунодепрессии, вызванной цитостатиком азатиоприном, который вводили контрольной группе животных в дозе 50 мг/кг перорально 1 раз в сутки в течение 5 дней.

Объектами настоящего исследования явились следующие соединения:

• а)    Фракции, полученные из экстракта софоры желтоватой:

• 1.    Хлороформная фракция (ХФ) - агликоны тритерпеновых кислот и флавоноиды халконового типа (кураридин), кумарины (скополетин, умбеллиферон).

• 2.    Этилацетатная фракция (ЭАФ) - флаваноны (кушенол А, изокураринон, кураридин, софорафла-ванон G, кураринон, изоксантогумол), следы алкалоидов.

• 3.    Спиртовая фракция (СФ) - тритерпеновые гликозиды, алкалоиды (матрин, N-окись матрина).

• 4.    Полисахаридная фракция (ПФ) - водорастворимые полисахариды с доминирующей группой а-4,6-глюканов.

• б)    Флаваноны из софоры желтоватой (софорафлаванон G и кураринон):

  

Кураринон

В.) Полисахариды из растительного сырья

Вид (морфологическая группа) Название биополимера, класс, физико-химические характеристикив Acoraceae Аир болотный (Acorus calamus) (к) AcWG-2: α-4,6-глюкан, [α]D +171°, м.м. 175 кДа, Kbr 5.2% Fabaceae Астрагал перепончатый (Astragalus membranaceus) (к) Софора желтоватая (Sophora fla-vescens) (к) AmG-2-1: линейный α-1,4-глюкан, [α]D +87°, м.м. 90 кДа, Kbr 0% AmG-2-3: α-4,6-глюкан, [α]D +95.7°, м.м. 204 кДа, Kbr 12.7% SfP-1-1/2: α-4,6-глюкан, [α]D +155.7°, м.м. 85 кДа, Kbr 10.7% Lamiaceae Мята перечная (Mentha piperit) (л) Зопник клубненосный (Phlo-moides tuberose) (к) Шлемник байкальский (Scutellaria baicalensis) (к) MPP′′: рамногалактуронан, [α]D +189°, м.м. 30 кДа PtWP-2/1-2: α-4,6-глюкан, [α]D +153°, м.м. 164 кДа, Kbr 30.4% SbRP-1′′: α-4,6-глюкан, [α]D +188°, м.м. 110 кДа, Kbr 8.3% Zingiberaceae Кардамон настоящий (Elletaria cardamomum) (с) Имбирь лекарственный (Zingiber officinalis) (к) ECW-1-2: α-4,6-глюкан, [α]D +182°, м.м. 166 кДа, Kbr 46.1% ZoWPS-1-2: α-4,6-глюкан, [α]D +127°, м.м. 215 кДа, Kbr 21.7% к – корни, л – листья, с – семена, м.м. – молекулярная масса, Kbr – степень разветвленности основной цепи

Индивидуальные соединения вводили опытным группам мышей на фоне азатиоприна перорально 1 раз в сутки в течение 14 дней. Интактная группа животных получала воду, очищенную по аналогичной схеме.

Действие испытуемых веществ на состояние клеточного звена иммунного ответа оценивали в реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ), согласно стандартной методике локальной ГЗТ [5]. Мышей сенсибилизировали внутрибрюшинным введением 0,1 %-ной взвеси эритроцитов барана (ЭБ) в физиологическом растворе. На 4-е сутки под подошвенный апоневроз задней лапки вводили разрешающую дозу антигена - 50 мкл 50%-ной взвеси ЭБ. В контрлатеральную лапку инъецировали физиологический раствор в том же объеме. Оценку реакции ГЗТ проводили спустя 24 ч по разнице массы опытной (Ро) и контрольной (Рк) лапок.

Состояние гуморального иммунитета оценивали по количеству антителообразующих клеток (АОК), определяемых методом локального гемолиза по A.J. Cunningham (1965) [9]. Мышей иммунизировали внутрибрюшинно ЭБ в дозе 2 х108 клеток/мышь. Величину иммунного ответа оценивали по числу АОК на селезенку и на 106 клеток с ядрами на 5-е сутки после иммунизации.

При статистической обработке экспериментальных данных вычислялась средняя арифметическая (М), ошибка средней арифметической ((m), критерий Стьюдента (t) и достоверность различий (Р). Различие считали достоверным при вероятности 95% (Р ( 0,05).

Результаты и их обсуждение

Ранее нами сообщалось об иммуномодулирующем действии сухого экстракта софоры желтоватой при экспериментальной азатиоприновой иммуносупрессии [7]. В данной работе показано, что исследуемое средство способно ослаблять супрессивное действие цитостатика азатиоприна на клеточноопосредованную иммунную реакцию (гиперчувствительность замедленного типа), антителогенез и фагоцитоз макрофагов, что выражается в восстановлении иммунологических показателей до уровня таковых у интактных животных. В настоящей работе с целью выяснения роли биологически активных веществ в иммуномодулирующем действии экстракта софоры желтоватой представляло интерес исследование фракций, полученных из корней софоры желтоватой, на предмет наличия иммуномодулирующей активности.

При исследовании влияния выделенных из экстракта софоры желтоватой фракций на процессы антителообразования установлено, что данные извлечения восстанавливают показатели гуморального иммунного ответа в условиях азатиоприновой иммуносупрессии (табл. 1).

Таблица 1

Влияние фракций софоры желтоватой на антителообразование

Группы животных	Абсолютное число АОК на селезенку	Число АОК на 106 спленоци-тов
Интактная	50207 ± 3750	304 ± 15
Контрольная (азатиоприн)	26427 ± 1606	186 ± 12
Азатиоприн + ЭАФ	60999 ± 5074*	316 ± 13*
Азатиоприн + ХФ	77221±1797*	323±27*
Азатиоприн + СФ	42462±3989*	281±23*
Азатиоприн + ПФ	61096±3046*	315±24*

При введении ХФ, ПФ, ЭАФ и СФ на фоне иммуносупрессии наблюдали достоверное увеличение количества АОК как в абсолютных значениях, так и при расчете на 106 спленоцитов; при этом первый показатель превышал уровень азатиоприновой супрессии в 3,8; 2,3; 2,3 и 1,6 раза, а второй ─ в 1,7; 1,6; 1,7 и 1,5 раза соответственно (табл.1).

На основании проведенных исследований по оценке влияния выделенных из экстракта софоры желтоватой фракций на показатели гуморального звена иммунного ответа, их можно расположить в порядке убывания иммуномодулирующей активности следующим образом:

ХФ → ПФ=ЭАФ → СФ

На основании проведенных исследований по оценке влияния выделенных из ЭСЖ фракций на состояние клеточного звена иммунного ответа можно расположить их в порядке убывания иммуномодулирующей активности следующим образом: ПФ( ЭАФ(ХФ(СФ (табл. 2).

Таблица 2

Влияние фракций софоры желтоватой на выраженность реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ)

Группы животных	ИР ГЗТ, %
Интактная	41,73 ± 3,99
Контрольная (азатиоприн)	27,26 ± 1,35
Азатиоприн + ЭАФ	39,24 ± 3,45*
Азатиоприн + ХФ	35,54 ± 2,93*
Азатиоприн + СФ	32,7 ± 2,24*
Азатиоприн + ПФ	43,71 ± 1,01*

Таким образом, при исследовании иммуномодулирующей активности фракций, полученных из софоры желтоватой, установлено наиболее выраженное влияние полисахаридной фракции, содержащей водорастворимые полисахариды с доминирующей группой а-4,6-глюканов, и этилацетатной, в которой отмечено высокое содержание полифенольных веществ: флаванонов (кушенол А, изокураринон, кураридин, софо-рафлаванон G, кураринон, изоксантогумол). Эти данные позволяют утверждать, что за иммуномодулирующий эффект экстракта софоры желтоватой ответственны содержащиеся в нем полисахариды и флавоноиды. Присутствие глюканов в составе таких растительных иммуномодуляторов как шлемник байкальский, софора желтоватая, астрагал перепончатый и др., помимо других классов соединений, например, фенольной или терпеновой природы, указывает на их возможное совместное участие в формировании общего действия на организм. В связи с этим нами было проведено сравнительное исследование иммуномодулирующей активности полисахаридов и доминирующих низкомолекулярных метаболитов. На примере компонентов корней софоры желтоватой было установлено, что в модели азатиоприновой супрессии у мышей глюкан SfP-1-1/2 и два доминирующих пренилированных флаванона – софорафлаванон G и кураринон обладают близкой степенью активности, причем глюкан SfP-1-1/2 по выраженности реакции ГЗТ превосходит эффект флавоноидов (рис. 1).

Рис. 1. Влияние глюкана SfP-1-1/2, софорафлаванона G и кураринона на антителообразование (АОК/106 спленоцитов) - а) и б) - выраженность реакции ГЗТ, %. Экспериментальные группы: 1 – интактная, 2 – азатиоприн (50 мг/кг, А), 3 – А + SfP-1-1/2 (50 мг/кг), 4 – А + софорафлаванон G (50 мг/кг), 5 – А + кураринон (50 мг/кг)

При исследовании иммуномодулирующих свойств полисахаридов из растительного сырья установлено, что выделенные представители α-глюканов обладают различными структурными особенностями и разной выраженностью действия, однако следует отметить, что наибольшее влияние на активность оказывает такой параметр, как степень разветвления кора макромолекулы. Так, для линейного глюкана A. membranaceus (AmG-2-1) она минимальная, а для глюкана E. cardamomum (ECW-12) со степенью разветвления кора 46.1% – наибольшая (рис. 2).

AcW(t-2

Рис. 2. Влияние α-4,6-глюканов на гуморальный иммунитет в условиях азатиоприновой иммуносупрессии. По оси абсцисс – степень разветвленности (Kbr), %; по оси ординат – количество АОК/106 спленоцитов. RE – график уравнения линейной регрессии: y = 14.021x + 78.596, r2 = 0.6645

Полученные результаты описываются линейной зависимостью со значением коэффициента детерминации больше 0.6. Также было отмечено влияние молекулярной массы полимеров на проявление у них иммуностимулирующих свойств, причем в ряду от глюкозы до полимеров с м.м. 100-300 кДа они возрастают, после чего снижаются.

Наши данные по исследованию иммуномодулирующей активности полифенольных соединений и полисахаридов согласуются с данными работы О.С. Борсук и др. (2011), в которой установлено, что курсовое введение мышам полифенольных и полисахаридных соединений, полученных из календулы лекарственной, крапивы двудомной и сафлора красильного, оказывает стимулирующее влияние на гуморальный, клеточный иммунный ответ и неспецифическую резистентность организма, а также способствует коррекции иммуносупрессии, вызванной введением цитостатика циклофосфана [1].

На основании проведенных исследований по выявлению иммуномодулирующей активности индивидуальных соединений из лекарственных растений можно заключить, что флавоноиды и полисахариды являются основными эффективными иммунокорректорами, что позволяет проводить целенаправленный поиск новых эффективных и малотоксичных иммунокорригирующих препаратов среди веществ растительного происхождения, содержащих указанные биологически активные вещества.