Влияние Гемобина-60 на развитие бифидобактерий в молоке

Здоровое и рациональное питание является одним из необходимых условий поддержания устойчивости организма человека к действию неблагоприятных экологических факторов и профилактики различных заболеваний. Однако в рационе питания у большинства населения России выявлен дефицит витаминов и микроэлементов. Активизировать защитные силы организма, нормализовать его функции и обмен веществ позволяют продукты, содержащие пробиотики или вырабатываемые с их помощью, например, некоторые кисломолочные продукты [1,2].

К заквасочным пробиотическим культурам, используемым в молочной промышленности относят штаммы бифидобактерий (Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum), лактобактерий (Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus plantarum), пропионово-кислых бактерий (Propionibacterium shermanii и др.). Заквасочная микрофлора преобразует компоненты молока в соединения, обуславливающие присущие кисломолочным продуктам органолептические, физико-механические и др. свойства [2, 3, 4].

Из литературных источников известно, что бифидобактерии в молоке обладают низкой биохимической активностью. Это увеличивает вероятность возникновения микробиологических рисков, возникающих при их производстве. Поэтому одной из проблем, требующей решения при производстве бифидосодержащих продуктов, является повышение активности бифидобактерий в процессе сквашивания молока. Ускорение развития этих микроорганизмов возможно с помощью стимуляторов роста [2, 3, 4, 5]. Известно несколько таких соединений органической и неорганической природы [6, 7, 8, 9], однако большая часть из них не может использоваться в пищевой промышленности из-за недостаточной изученности влияния на человеческий организм и др. факторов.

Известно, что рост бифидобактерий в молоке могут стимулировать микроэлементы, в частности, ионы железа [2, 10, 11]. Они принимают участие в ферментативных и окислительных процессах (железопорфириновые ферменты). Ионы железа также снижают окислительно-восстановительный потенциал среды, что особенно актуально для бифидобактерий, так как они являются строгими анаэробами. Кроме того двухвалентное железо обладает каталазной активностью и способно разрушать токсичные для микробной клетки перекиси и гидроксильные радикалы [2, 11].

Молоко как питательная среда для развития бифидобактерий содержит незначительное количество железа (на наш взгляд недостаточное для нормального развития этих бактерий), содержание которого значительно варьируется в течение года [2, 12]. Поэтому дополнительное внесение железа в усвояемой, в том числе для человека форме, должно стимулировать рост бифидобактерий в молоке и восполнять дефицит железа в организме человека.

Целью работы является исследование влияние Гемобина-60 (органическая форма железа, разрешенная к использованию в пищевой промышленности) на развитие бифидобактерий в молоке.

Объектами исследований служили бифидобактерии (Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium adolescentis), взятые из коллекции ВГМХА имени Н.В. Верещагина, «Гемобин-60». Опыты проводили в трехкратной повторности на восстановленном с использованием бидистиллированной воды обезжиренном молоке одного состава. Выбранные виды бифидобактерий, широко применяются при производстве бифидосодержащих молочных продуктов.

При проведении экспериментов применялись общепринятые методы микробиологических и физико-химических исследований. Определение температуры осуществляли по ГОСТ 26754-85. Титруемую кислотность определяли по ГОСТ 3624-92, активную кислотность – при помощи рН-метра. Определение бифидобактерий осуществляют по МУК 4.2.999-00.

Математическую обработку экспериментальных данных проводили с применением программы Microsoft Excel и Statistica.

Для обогащения молока ионами железа использовали пищевую добавку «Гемобин-60», разрешенную к применению в молочной промышленности. Известно, что микроэлементы в органической форме более легко и полно усваиваются организмом человека. Характеристика пищевой добавки «Гемобин-60» приведена в таблице 1.

Таблица 1. Характеристика пищевой добавки «Гемобин-60»

Показатель                                  Данные

Внешний вид и цвет	Коричнево-бурый порошок
Вкус и запах	Свойственный свежей крови
Массовая доля влаги, %, не более	6
Массовая доля золы, %, не более	7
Массовая доля белка, %, не менее	90
Содержание гемоглобина, %, не менее	60
Содержание железа, мг/кг, не менее	1600
Растворимость, 1 г в 50 мл дистиллированной воды, мин., не более	20

Пищевую добавку вносили в обезжиренное молоко в виде водного раствора перед пастеризацией молока. С учетом литературных данных, были выбраны концентрации железа от 1 до 10 мг/дм3. Молоко пастеризовали при температуре (87±2) °С с выдержкой 10 мин., охлаждали до температуры 37 оС, оптимальной для развития бифидобактерий, вносили 5 % закваски и сквашивали при оптимальной температуре до образования сгустка. В качестве контроля использовали обезжиренное молоко без внесения добавки.

Активность развития бифидобактерий контролировали по изменению титруемой и активной кислотности и количеству жизнеспособных клеток через 24 часа культивирования.

Результаты исследований по влиянию пищевой добавки «Гемобин-60» на кислотообразующую активность бифидобактерий, количество жизнеспособных клеток в молоке и продолжительность сквашивания показаны в таблице 2 и на рисунках 1, 2.

Таблица 2. Влияние «Гемобин-60» на кислотообразующую активность бифидобактерий

Вид микроорганизмов	Доза внесения Гемобина-60, мг/дм3
	контроль	1,0	2,5	4,0	5,5	7,0	8,5	10,0
Титруемая кислотность в конце сквашивания, ºТ
Титруемая кислотность
Bifidobacterium longum	75±1,0	87±1,1	83±1,0	81±0,6	79±0,6	78±1,0	76±1,1	75±0,6
Bifidobacterium adolescentis	76±1,0	86±1,0	84±0,6	82±1,1	80±1,0	79±0,6	77±1,1	76±1,0

Вид микроорганизмов	Доза внесения Гемобина-60, мг/дм3
	контроль	1,0	2,5	4,0	5,5	7,0	8,5	10,0
Bifidobacterium bifidum	74±0,6	85±1,0	82±1,0	78±1,0	77±1,0	75±0,6	74±1,0	73±1,0
Активная кислотность в конце сквашивания
Bifidobacterium	4,73±	4,62±	4,66±	4,68±	4,69±	4,7±	4,71±	4,72
longum	0,006	0,01	0,011	0,006	0,006	0,011	0,01	±0,006
Bifidobacterium	4,75±	4,59±	4,63±	4,68±	4,69±	4,72±	4,74±	4,74±
adolescentis	0,011	0,011	0,01	0,011	0,01	0,01	0,011	0,01
Bifidobacterium	4,76±0,	4,62±	4,66±	4,69±	4,7	4,73±	4,74±	4,74±
bifidum	006	0,011	0,01	0,01	±0,006	0,01	0,006	0,006

Рисунок 1. Влияние Гемобина-60 на количество жизнеспособных клеток бифидобактерий в молоке.

Рисунок 2. Влияние Гемобина-60 на продолжительность сквашивания бифидобактерий в молоке.

Как видно из представленных данных, обогащение молока добавкой «Гемобин-60» из расчета содержания железа (1-10) мг/дм3 оказало положительное влияние на развитие всех исследуемых видов бифидобактерий. Наибольший стимулирующий эффект проявлялся при минимальных концентрациях железа в молоке, равных (1-2,5) мг/дм3 при этом продолжительность сквашивания сокращалась в среднем на 20 %, а количество жизнеспособных клеток увеличивалось на 10 %, в зависимости от исследуемого вида. Так как оптимальная для ускорения развития концентрация органического железа (Гемобин–60) находилась в крайней точке факторного пространства, для уточнения эффективной дозы внесения добавки был смещен диапазон исследуемых концентраций (0,1-1,5) мг/дм3 и уменьшен шаг фактора (табл. 3, рис. 3 ).

Таблица 3. Влияние «Гемобин-60» на активность развития бифидобактерий

Вид микроорганизмов	Доза внесения Гемобина-60, мг/дм3
	контроль	0,1	0,3	0,5	0,7	0,9	1,1	1,3	1,5
Титруемая кислотность в конце сквашивания, ºТ
Bifidobacterium longum	75±1,0	76±1,0	78±1,0	80±1,0	83±0,6	85±1,0	87±1,0	88±1,1	89±0,6
Bifidobacterium adolescentis	76±1,0	76±1,0	78±1,0	81±1,0	83±1,0	85±0,6	86±1,1	87±1,0	89±1,0
Bifidobacterium bifidum	74±0,6	75±1,0	77±1,0	80±0,6	83±1,0	84±1,0	85±0,6	87±1,1	88±0,6
Активная кислотность в конце сквашивания (через 24 часа)
Bifidobacterium	4,73±	4,72±	4,69±	4,68±	4,66±	4,63±	4,62±	4,6±	4,6±
longum	0,006	0,011	0,01	0,01	0,011	0,01	0,006	0,006	0,006
Bifidobacterium	4,75±	4,73±	4,69±	4,66±	4,63±	4,6±	4,59±	4,6±	4,59±
adolescentis	0,011	0,01	0,006	0,01	0,01	0,01	0,01	0,01	0,01
Bifidobacterium	4,76±	4,74±	4,69±	4,66±	4,64±	4,63±	4,62±	4,63±	4,61±
bifidum	0,006	0,01	0,006	0,011	0,01	0,011	0,006	0,011	0,01
Количество жизнеспособных клеток в конце сквашивания, ln КОЕ/г (через 24 часа)
Bifidobacterium	17,8±0,2	17,9±	17,95±	18±	18,5±	18,8±	19,0±	19,2±	19,3±
longum		0,13	0,11	0,16	0,11	0,15	0,14	0,13	0,1
Bifidobacterium	18,05±	18±0,15	18,1±	18,5±	19±	19,2±	19,25	19,37	19,4±
adolescentis	0,12		0,2	0,16	0,18	0,14	0,18	0,11	0,14
Bifidobacterium	18,3±	18,2±	18,4±	18,8±	18,9±	19,1±	19,22±	19,34±	19,5±
bifidum	0,18	0,15	0,12	0,17	0,13	0,2	0,14	0,16	0,12

Установлено, что наибольшая активность кислотообразования и максимальный выход жизнеспособных клеток бифидобактерий наблюдались при концентрации ионов железа, равной (0,9-1,5) мг/дм3.

Математическая обработка результатов эксперимента в данном факторном пространстве позволила вывести следующие регрессионные уравнения, адекватно отражающие зависимости изменения кислотности и количества жизнеспособных клеток при развитии бифидобактерий в молоке от концентрации ионов железа (так как существенных различий в показателях процесса сквашивания молока между разными видами бифидобактерий не выявлено математические модели построены по средним значениям всех культур бифидобактерий):

У1 =1,8533х+72,8               R21 =0,9818;

У2 = 4,7647х-0,016              R22= 0,9685;

У3 = 0,1977x + 17,714           R23 = 0,9591.

где У1 – титруемая кислотность, °Т;

• У2 – активная кислотность, ед. рН;

• У3 – количество жизнеспособных клеток, ln КОЕ/г;

Х – концентрация ионов железа, мг/дм3;

• R2 – коэффициент детерминации.

Высокие значения коэффициентов детерминации подтверждают достоверность полученных зависимостей.

Рисунок 3. Изменение кислотности в процессе сквашивания B. longum.

О повышении активности развития бифидобактерий при обогащении молока ионами железа свидетельствует расчет удельных скоростей роста и кислотообра-зования при их развитии в молоке, определяемых по формуле:

2,31g(x - О где µ – удельная скорость роста в процессе сквашивания, ч-1;

• х – биомасса в начальный момент времени (биомасса в начале логарифмической фазы);

хо – биомасса в конечный момент времени (биомасса в конце логарифмической фазы);

t – время (продолжительность логарифмической фазы), ч.

Средняя скорость кислотообразования, °Т ч-1:

т- т, средняя скорость кислотообразования = —-— где Т – титруемая кислотность в конце сквашивания, °Т;

Т0 – титруемая кислотность в начале сквашивания, °Т.

Средняя скорость изменения рН, рН ч-1:

pH - pHD средняя скорость кислотообразования =------- где рН – активная кислотность в конце сквашивания, ед. рН;

рН0 – активная кислотность в начале сквашивания, ед. рН.

В таблице 4 показано изменение этих параметров для Bifidobacterium longum при концентрации ионов железа – 1 мг/дм3.

Таблица 4. Параметры роста Bifidobacterium longum

Показатель	Варианты
	контроль	опыт
Средняя удельная скорость роста в процессе сквашивания, ч-1	0,0193±0,0060	0,032±0,0062
Средняя удельная скорость роста в логарифмической фазе, ч-1	0,0482±0,0073	0,0959±0,0084
Средняя скорость кислотообразования, °Т ч-1	2,32±0,26	3,86±0,34
Средняя скорость изменения рН, рН ч-1	1,35±0,21	1,91±0,27

Определение продолжительность лаг-фазы (начальной) и лог-фазы (логарифмической) осуществляли графическим методом Лоджа и Хиншельвуда.

Длительность лаг-фазы (фазы в течение которой бактерии адаптируются к питательной среде), при культивировании бифидобактерий с добавлением железа сокращается на 8–10 %, что снижает риск развития посторонней микрофлоры на начальном этапе сквашивания, когда скорость кислотообразования не значительна.

Поскольку существенных различий в выходе жизнеспособных клеток бифидобактерий между концентрациями ионов железа (0,9-1,5) мг/дм3, в зависимости от вида бифидобактерий, выявлено не было, то для активизации развития бифидобактерий может быть рекомендована более низкая доза внесения «Гемобина-60» – (0,9-1,1) мг/дм3.

Таким образом, результаты выполненных исследований показали, что при использовании Гемобина-60 увеличивается количество жизнеспособных клеток в конечном продукте на 10 %, сокращается продолжительности сквашивания на 20 %, что позволяет получать продукт гарантированно высокого качества. Также установлено, что Гемобин-60 одинаково положительно действует на все исследуемые виды бифидобактерий.