Влияние гипо- и гипертермии на коагуляционный гемостаз коров и кур in vitro

Нарушение гемостаза является патогенетической основой многих болезней [1] и летальных исходов у кур и крупного рогатого скота, а также других животных, в связи с чем актуальна разработка диагностических, профилактических и терапевтических методов нормализации гемостаза у животных. Температура тела является одним из важнейших параметров гомеостаза, а также фактором регуляции функционирования живых систем [2]. Изменения системы гемостаза при гипертермическом воздействии широко изучается фундаментальной медициной в связи с успешным применением данного воздействия при лечении онкологических, аллергических, аутоиммунных и инфекционных заболеваний [3].

В связи с тем, что продуктивные животные и птицы имеют температуру тела, сильно отличающуюся от человеческой, методы оценки гемостаза, принятые в гуманной медицине могут не подходить для оценки гемостаза животных, но поскольку гемостазиологические оценки постепенно становятся важными для диагностики здоровья животных и для углубления существующих представлений о клеточных механизмах адаптации организма к температурным режимам, адаптированная и стандартизированная методология анализа свертывания крови продуктивных животных важна и срочно необходима [4].

Цель работы – определение зависимости скорости коагулологических реакций крови продуктивных животных от температуры инкубации плазмы.

Задачи исследования:

определить показатели коагуляционной активности крови коров in vitro при гипо- и гипертермии;

оценить показатели коагуляционной активности крови кур in vitro при гипо- и гипертермии;

провести корреляционно-регрессионный анализ полученных данных.

Материалы и методы

Работа выполнена в 2023 г. в Вологодской ГМХА имени Н.В. Верещагина при финансовой поддержке Российского научного фонда № 23-26-00115,

В исследовании использовали кровь 15 здоровых коров айрширской породы ( Bostaurus L., 1758) с привязным содержанием, в возрасте от 4 до 6 лет, разных стадий лактации и живой массой 400–480 кг, принадлежащих СПК «Агрофирма Красная Звезда» Вологодского района, и 19 здоровых кур-несушек ( Gallusgallus L., 1758), породы Род-Айленд красная, кросс Хайсекс Браун, принадлежащих СХПК «Племптица-Можайское», возрастом 2 года и весом 1900 г. Птица содержалась в четырехъярусных клетках производства компании «VALLI».

У птиц кровь получали в стеклянные пробирки, содержащие 3,8%-ный раствор цитрата натрия в соотношении 1:9 пункцией подкрыльцовой вены.

Отбор проб крови у коров проводился в вакуумные пробирки IMPROVACUTER, содержащие 3,8%-ный раствор цитрата натрия в соотношении 1:9 из хвостовой вены.

Объектом исследования являлась бедная тромбоцитами плазма, полученная в результате центрифугирования крови при 3000 оборотов в минуту в течение 20 мин [5, 6].

Для оценки состояния плазменно-коагуляционного гемостаза определяли следующие показатели: АЧТВ (активированное частичное тромбопластиновоевремя),ПВ(протромбиновоевремя),ТВ(тромбиновое время) и анализ активности фибриногена [7, 8]. Эти тесты основаны на триггерных реагентах, вызывающих образование фибринового сгустка в образце в присутствии фосфолипидов и кальция. Тромб обнаруживали механическим способом, основанным на измерении времени с момента внесения реагента, запускающего ферментативный процесс свертывания, до момента коагуляции (клоттинговыми методами) при температуре 37°С на коагулометре «Thrombostat» производства BehnkElektronik (Германия) и мануально (при периодическом покачивании пробирки) с использованием термостата медицинского водяного, серии TW: TW-2 (ELMI TW-2) при температуре 43°C, 40°C, 28°C, 24°C и 18°C . Были использованы медицинские наборы: «Тромбо-тест», «Техпластин-тест», «АПТВ-тест», «РФМК-тест планшетный вариант» и активность фибриногена (НПО РЕНАМ, Россия). Все исследования проводились в соответствии с инструкциями к реагентам [7, 8].

Антикоагуляционные свойства крови оценивали по активности Антитромбина III в плазме с помощью Тех-Антитромбин-теста при 18°C, 24, 28, 37, 40, 43°C. Принцип метода состоял в том, что Антитромбин III из плазмы, подвергнутой тепловому дефибринированию, инактивировал α-тромбин. Тестировали остаточную активность тромбина через 2 мин от начала инкубации дефибринированной плазмы с тромбином при разных температурах. По времени свёртывания оценивали активность Антитромбина III образца (принцип U.Abildgaard в модификации А.П. Момота и А.Н. Мамаева) [8].

Нормальность распределения данных оценивали при помощи критерия Шапиро-Уилка и Колмогорова-Смирнова. Для оценки достоверности различий параметров между видами в парных независимых выборках использовали критерий Манна-Уитни, для различий параметров при разных температурах в множественных зависимых выборках использовали критерий Вилкоксона. Силу парной линейной связи между переменными оценивали при помощи непараметрического коэффициента корреляции Спирмана (R). Качественную интерпретацию силы связи между показателями коагулограммы и температурой инкубации плазмы выполняли на основе шкалы Чеддока. Влияние температурного фактора оценивали с помощью теоретического коэффициента детерминации (R ² ). Проверка статистической значимости коэффициентов корреляции осуществлялась с помощью статистического критерия Фишера (однофакторный дисперсионный анализ, One-way ANOVA) [9].

Результаты исследований

Исследования in vitro плазмы коров показали, что гипо- и гипертермия приводили к изменению каскада коагуляции (табл. 1).

Таблица 1 - Сравнительный анализ показателей гемостаза коров при разных температурах

Показатель (n=15)	18	Температура, °С
		37	40	43
ТВ, с	50,09±6,22dg	26,54±1,74afg	45,17±4,63dg	18,01±2,11adf
ПВ, с	89,51±12,79dfg	55,13±13,68ag	34,57±1,68ag	24,88±2,58adf
АЧТВ, с	353,09±14,89dfg	62,83±2,34a	64,31±6,85a	88,91±29,19a
Активность фибриногена, с	130,15±27,00 dfg	12,46±1,20 afg	23,90±5,67 ad	24,77±5,45 ad
Антитромбин, с	65,99±6,79df	10,53±0,44ab	10,11±0,22ab	4,95±1,35
aРазличия с аналогичным параметром при 18°С достоверны (p≤0,05) dРазличия с аналогичным параметром при 37°С достоверны (p≤0,05) fРазличия с аналогичным параметром при 40°С достоверны (p≤0,05) gРазличия с анал огичным параметром при 43°С достоверны (p≤0 ,05)

Корреляционно-регрессионный и однофакторный дисперсионный анализ (One-way ANOVA) выявили высокую зависимость от температуры ПВ и АЧТВ, коэффициент детерминации которых составил 60 и 44% соответственно (рис. 1).

Поле корреляции _{у =} __8Л64х ₊ 374,92 R² = 0,4401

V) t	500,00 400,00
1 1 CL <	300,00
■^	200,00
со	100,00
zr <	0,00

Температура, °C

Рисунок 1 - Корреляционно-регрессионная зависимость ПВ и АЧТВ плазмы коров от температуры инкубации

В соответствии со шкалой Чеддока корреляционную связь между показателями гемостаза коров и температурным фактором можно охарактеризовать как отрицательную умеренную (АЧТВ; r=-0,44), заметную (ТВ, фибриноген; r=-0,51) и тесную (ПВ, АТ-III; r=-0,80)

У кур в результате изменения температуры инкубации плазмы были получены показатели активности свертывающего и противосвертывающего звена гемостаза представленные в таблице 2.

Таблица 2 - Сравнительный анализ показателей гемостаза кур при разных температурах

Показатель (n=19)	18	Температура, °С 37          43		46
ТВ, с	149,97±11,32cdf	46,39±1,74a	45,52±1,64a	32,43±3,65a
ПВ, с	29,33±6,37cd	83,13±15,36adf	154,64±41,71aсf	43,71±13,99cd
АЧТВ, с	84,72±15,23	64,56±7,67	78,82±12,41	86,86±17,56
Активность фибриногена, с	25,35±4,99cdf	93,88±9,75af	109,15±11,27af	395,60±32,99acd
Антитромбин, с	11,81±2,62cdf	30,70±2,48a	26,02±1,70a	24,46±2,08a
aРазличия с аналогичным параметром при 18°С достоверны (p≤0,05) cРазличия с аналогичным параметром при 37°С достоверны (p≤0,05) dРазличия с аналогичным параметром при 43°С достоверны (p≤0,05) f Различия с аналогичным параметром при 46°С достоверны (p≤0,05).

Корреляционно-регрессионный и однофакторный дисперсионный анализ (One-way ANOVA) у кур выявили высокую зависимость от тем- пературы ТВ и активности фибриногена, коэффициент детерминации которых составил 71 и 39% соответственно (рис. 2).

Поле корреляции v = -4,i238x + 2i5,i

R2 = 0,7057

Поле корреляции     у = 8,87эзх-1бо,б4

R2 = 0,3934

Рисунок 2 - Корреляционно-регрессионная зависимость ТВ и активности фибриногена плазмы кур от температуры инкубации

В соответствии со шкалой Чеддока корреляционную связь между показателями гемостаза кур и температурным фактором можно охарактеризовать как отрицательную высокую (ТВ; r=-0,8) и положительную высокую (фибриноген; r=0,8).

Сравнивая динамику показателей гемостаза кур и коров, можно отметить однотипность реакций тромбинового и активированного частичного тромбопластинового времени на изменение температуры инкубации плазмы и совершенно разные реакции протромбинового времени, активности фибриногена и антитромбина у этих животных (рис. 3, 4).

Динамика ТВ

Динамика АЧТВ

О

для кур) для кур)

Температура, °C

^—ТВ коров, с ^—ТВ кур, с

Рисунок 3 - Реакция ТВ и АЧТВ коров и кур на изменение температуры

Динамика активности ^ антитромбина

18             37       40 (43 для кур) 43 (46 для кур)

Температура, °C

^^—Антитромбин коров, с ^^—Антитромбин кур, с

Рисунок 4 - Реакция ПВ, активности фибриногена и антитромбина коров и кур на изменение температуры

Обсуждение

Повышение температуры инкубации плазмы крови коров приводит к гиперкоагуляции крови in vitro, активируя каскад свертывания и угнетая активность противосвертывающей системы, гипотермия оказывает обратный эффект на эти два звена системы гемостаза. Полученные результаты согласуются с результатами зарубежных авторов, которые делают вывод, что гиперкоагуляции во время теплового удара вызывает локальную гипоперфузию, тканевую гипоксию и последующую органную дисфункцию [10], а гипотермия на модельных организмах может служить защитой от повышенного тромбообразования [11].

Анализируя полученные результаты можно заключить, что большая часть показателей, характеризующих плазменный гемостаз кур, ярко реагирует на изменение температуры инкубации, особенно на гипотермию, поэтому оптимизация диагностических процедур и определение референтных значений показателей свертываемости крови у птиц при температуре, свойственной этим позвоночным, могут улучшить диагностику нарушений гемостаза. Мы согласны с M. Buzala с соавторами, что процессы свертывания крови глубоко заложены в геноме современной домашней птицы, и поэтому признание механизмов гемостаза и улучшение диагностических процедур могут стать очень мощным инструментом генетического отбора [12].

Выводы

В результате проведенных исследований определено, что в плазме крови коров при гипертермии in vitro происходит укорочение тромбинового (ТВ) и протромбинового времени (ПВ), что свидетельствует о риске тромбообразования и может наблюдаться при первой фазе ДВС-синдрома (гиперкоагуляции) [13–16].

Выявлено, что активность антитромбина III при охлаждении плазмы коров до 18 oC выросла на 85% по сравнению с нормотермией (40oC), что согласуется с данными других исследователей, которые заключают, что легкая гипотермия оказывает антикоагулянтное действие при охлаждении и это может оказывать ингибирующее действие на образование микротромбов [11,17, 18, 19].

У кур ответ плазменного гемостаза сопровождался активацией свертывания крови и снижением активности антитромбина как при гипертермии (46°С), так и при гипотермии (18°С). Корреляционнорегрессионный и однофакторный дисперсионный анализ выявили высокую зависимость от температуры тромбинового времени птиц, коэффициент детерминации которого составил 71%.

Сравнивая реакцию показателей коагулограммы коров и кур на изменение температуры инкубации плазмы, можно отметить однотипность реакций тромбинового и активированного частичного тромбопластинового времени и совершенно разные реакции протромбинового времени, активности фибриногена и антитромбина у этих животных.

Исследование выполнено при финансовой поддержке Российского научного фонда № 23-26-00115,