Выявление соматических мутаций в гене BRAF методом пиросеквенирования
Автор: Дрибноходова Ольга Павловна, Дунаева Елена Алексеевна, Лешкина Гульнара Витальевна, Ярыгина Екатерина Андреевна, Бухарина Анна Юрьевна, Войцеховская Яна Александровна, Борисова Эльза Валериевна, Бормотова Светлана Константиновна, Дауд Антонина Игоревна, Хлявич Виталий Николаевич, Миронов Константин Олегович
Журнал: Сибирский онкологический журнал @siboncoj
Рубрика: Лабораторные и экспериментальные исследования
Статья в выпуске: 5 т.20, 2021 года.
Бесплатный доступ
Введение. Определение соматических мутаций в гене BRAF может применяться в клинике для уточнения диагноза, выбора терапии и оценки прогноза заболевания. Технология пиросеквенирования позволяет выявлять как уже известные, так и новые мутации, а также определять долю мутантного аллеля в образце. Цель исследования - разработка методики для выявления мутаций в 592-601 кодонах гена BRAF с помощью пиросеквенирования. Материал и методы. Определяли нуклеотидную последовательность с использованием системы генетического анализа «PyroMark Q24». Аналитические характеристики методики определяли на разведениях образцов плазмидной ДНК, включающих участок гена BRAF без мутаций или с одной из мутаций V600E, V600R, V600K, V600M, К601Е. Апробацию провели на 200 образцах биологического материала из узловых образований щитовидной железы. результаты. Разработанная методика позволяет определять образцы, содержащие 2 % мутантного аллеля для мутаций V600K и V600R, 3 % для V600E и V600M и 10 % для K601E. Значения сигнала для образцов без мутаций составили для разных мутаций от 0 до 19,5 %. Разработан алгоритм анализа для подтверждения наличия и дифференцировки мутаций в 600 кодоне на основе соотношения сигналов на пирограмме при низкой доле мутантного аллеля. При тестировании узловых образований щитовидной железы было обнаружено 47 образцов с мутациями, из них 45 с V600E и 1 с V600_K601>E, для одного образца не удалось установить тип мутации в 600 кодоне. Доля мутантного аллеля составляла 3,5-45 %. Концентрация выделенной ДНК менее 10 копий/мкл была получена в 47 образцах, из них в 8 образцах была обнаружена мутация. заключение. Разработана методика для выявления соматических мутаций в 592-601 кодонах гена BRAF. Методика обеспечивает достаточную чувствительность для выявления частых мутаций в 600 кодоне и позволяет определять редкие мутации. Выделение ДНК из образцов, полученных при тонкоигольной аспирационной биопсии, в большинстве случаев обеспечивало достаточную концентрацию ДНК, что позволяет использовать методику в комплексе с цитологическим анализом без дополнительного забора материала. Использованный подход может быть применен для определения соматических мутаций во фрагментах ДНК сопоставимой длины для других онкогенов.
Пиросеквенирование, braf, онкогенетика, тонкоигольная аспирационная биопсия, рак щитовидной железы
Короткий адрес: https://sciup.org/140261337
IDR: 140261337 | DOI: 10.21294/1814-4861-2021-20-5-75-83
Список литературы Выявление соматических мутаций в гене BRAF методом пиросеквенирования
- Zaman A., Wu W., Bivona T.G. Targeting Oncogenic BRAF: Past, Present, and Future. Cancers (Basel). 2019; 11(8): 1197. doi: 10.3390/cancers11081197.
- Tate J.G., Bamford S., Jubb H.C., Sondka Z., Beare D.M., Bindal N., Boutselakis H., Cole C.G., Creatore C., Dawson E., Fish P., Harsha B., Hathaway C., Jupe S.C., Kok C.Y., Noble K., Ponting L., Ramshaw C.C., Rye C.E., Speedy H.E., Stefancsik R., Thompson S.L., Wang S., Ward S., Campbell P.J., Forbes S.A. COSMIC: the Catalogue Of Somatic Mutations In Cancer. Nucleic Acids Res. 2019; 47(D1): D941–D947. doi: 10.1093/nar/gky1015.
- Dumaz N., Jouenne F., Delyon J., Mourah S., Bensussan A., Lebbé C. Atypical BRAF and NRAS Mutations in Mucosal Melanoma. Cancers (Basel). 2019 Aug 8; 11(8): 1133. doi: 10.3390/cancers11081133.
- Ducreux M., Chamseddine A., Laurent-Puig P., Smolenschi C., Hollebecque A., Dartigues P., Samallin E., Boige V., Malka D., Gelli M. Molecular targeted therapy of BRAF-mutant colorectal cancer. Ther Adv Med Oncol. 2019 Jun 18; 11: 1758835919856494. doi: 10.1177/1758835919856494.
- Cibas E.S., Ali S.Z. The 2017 Bethesda System for Reporting Thyroid Cytopathology. Thyroid. 2017 Nov; 27(11): 1341–1346. doi: 10.1089/thy.2017.0500.
- Бельцевич Д.Г., Мудунов А.М., Ванушко В.Э., Румянцев П.О., Мельниченко Г.А., Кузнецов Н.С., Подвязников С.О., Алымов Ю.В., Поляков А.П., Фадеев В.В., Болотин М.В., Севрюков Ф.Е., Крылов В.В., Феденко А.А., Болотина Л.В., Жаров А.А., Фалалеева Н.А., Филоненко Е.В., Невольских А.А., Иванов С.А., Хайлова Ж.В., Геворкян Т.Г. Клинические рекомендации: Дифференцированный рак щитовидной железы. 2020. 47 c. [Интернет]. URL: http://cr.rosminzdrav.ru/#!/recomend/977 (дата обращения: 20.10.2020). [Beltsevich D.G., Mudunov A.M., Vanushko V.E., Rumyantsev P.O., Melnichenko G.A., Kuznetsov N.S., Podvyaznikov S.O., Alymov Yu.V., Polyakov A.P., Fadeev V.V., Bolotin M.V., Sevryukov F.E., Krylov V.V., Fedenko A.A., Bolotina L.V., Zharov A.A., Falaleeva N.A., Filonenko E.V., Nevol’skikh A.A., Ivanov S.A., Khailova Zh.V., Gevorkyan T.G. Clinical Guidelines: Differentiated Thyroid Cancer. 2020. 47 p. [Internet]. URL: http://cr.rosminzdrav.ru/#!/recomend/977 (cited: 20.10.2020). (in Russian)].
- Patel K.N., Yip L., Lubitz C.C., Grubbs E.G., Miller B.S., Shen W., Angelos P., Chen H., Doherty G.M., Fahey T.J.3rd, Kebebew E., Livolsi V.A., Perrier N.D., Sipos J.A., Sosa J.A., Steward D., Tufano R.P., McHenry C.R., Carty S.E. The American Association of Endocrine Surgeons Guidelines for the Definitive Surgical Management of Thyroid Disease in Adults. Ann Surg. 2020 Mar; 271(3): e21–e93. doi: 10.1097/SLA.0000000000003580.
- Haugen B.R., Alexander E.K., Bible K.C., Doherty G.M., Mandel S.J., Nikiforov Y.E., Pacini F., Randolph G.W., Sawka A.M., Schlumberger M., Schuff K.G., Sherman S.I., Sosa J.A., Steward D.L., Tuttle R.M., Wartofsky L. 2015 American Thyroid Association Management Guidelines for Adult Patients with Thyroid Nodules and Differentiated Thyroid Cancer: The American Thyroid Association Guidelines Task Force on Thyroid Nodules and Differentiated Thyroid Cancer. Thyroid. 2016 Jan; 26(1): 1–133. doi: 10.1089/thy.2015.0020.
- Poller D.N., Glaysher S. Molecular pathology and thyroid FNA. Cytopathology. 2017 Dec; 28(6): 475–481. doi: 10.1111/cyt.12492.
- Миронов К.О., Дунаева Е.А., Дрибноходова О.П., Шипулин Г.А. Опыт использования систем генетического анализа на основе технологии пиросеквенирования. Справочник заведующего КДЛ. 2016; 5: 33–42. [Mironov K.O., Dunaeva E.A., Dribnokhodova O.P., Shipulin G.A. Using genetic analysis system based on pyrosequencing method. Spravochnik zaveduyushchego KDL. 2016; 5: 33–42. (in Russian)].
- Дунаева Е.А., Миронов К.О., Дрибноходова О.П., Субботина Т.Е., Башмакова Е.Е., Ольховский И.А., Шипулин Г.А. Количественное определение мутации V617F в гене JAK2 методом пиросеквенирования. Клиническая лабораторная диагностика. 2014; 59(11): 60–63. [Dunaeva E.A., Миронов К.О., Dribnokhodova O.P., Subbotina T.N., Bashmakova E.E., Olhovskii I.A., Shipulin G.A. The quantitative testing of V617F mutation in gen JAK2 using pyrosequencing technique. Klinicheskaia laboratornaia diagnostika. 2014; 59 (11): 60–63. (in Russian)].
- Дрибноходова О.П., Миронов К.О., Дунаева Е.А., Маркелов М.Л., Войцеховская Я.А., Демидова И.А., Баринов А.А., Шипулин Г.А. Выявление активирующих соматических мутаций в гене KRAS методом пиросеквенирования. Клиническая лабораторная диагностика. 2013; 6: 49–51. [Dribnokhodova O.P., Mironov K.O., Dunaeva E.A., Demidova I.A., Barinov A.A., Voiciehovskaya Ia.A., Markelov M.L., Shipulin G.A. The detection of activating somatic mutations in gene KRAS using pyrosequencing technique. Klinicheskaia laboratornaia diagnostika. 2013; 6: 49–51. (in Russian)].
- Дунаева Е.А., Миронов К.О., Субботина Т.Н., Ольховский И.А., Шипулин Г.А. Разработка и сравнительная апробация методик для повышения чувствительности определения мутации V617F в гене JAK2 методом пиросеквенирования. Клиническая лабораторная диагностика. 2017; 62 (2): 125–128. [Dunaeva E.A., Mironov K.O., Subbotina T.N., Olkhovsky I.A., Shipulin G.A. The development and comparative approbation of methods of increasing sensitivity of detection of mutation V617F in gene JAK2 by pyrosequencing. Klinicheskaia laboratornaia diagnostika. 2017; 62 (2): 125–128. (in Russian)].
- Armbruster D.A., Pry T. Limit of blank, limit of detection and limit of quantitation. Clin Biochem Rev. 2008 Aug; 29 Suppl 1(Suppl 1): S49–52.
- Hou P., Liu D., Xing M. Functional characterization of the T1799-1801del and A1799-1816ins BRAF mutations in papillary thyroid cancer. Cell Cycle. 2007 Feb 1; 6(3): 377–9. doi: 10.4161/cc.6.3.3818.
