Анализ экспрессии гена LCORL у кур русской белой породы в реперные точки роста и физиологического созревания

LCORL – лигандзависимый ядерный рецептор, подобный корепрессору, является транскрипционным фактором и использует консервативный мотив спираль – поворот – спираль для связывания с ДНК. Активно функционирует при сперматогенезе и является одним из важнейших генов, который определяет рост и массу тела у животных [1]. У курицы (Gallus gallus) ген LCORL расположен на 4-й хромосоме (NC_052535.1/ 75353941…75426494), состоит из 8 экзонов и имеет 4 изоформы мРНК. Данный локус также включает ген NCAPG. Оба гена содержат перекрывающие области, что повышает возможность регулируемой альтернативной экспрессии [2]. LCORL действует совместно с семейством белков CHD с хромодоменной геликазой. Семейство ДНК- связывающих белков влияет на транскрипционную активность большого количества генов, опосредуя удаление, обмен или транслокацию нуклеосом АТФ-зависимым образом.

С. Sakaguchi с соавторами подтвердили образование комплекса CHD4-LCORL-NOL4L (ядрышковый белок) в линиях клеток человека с помощью иммунопреципитационного анализа. Чтобы исследовать функцию комплекса CHD4-LCORL-NOL4L, авторы провели транскриптомный анализ клеток, лишенных этих белков, и обнаружили общие изменения в профилях экспрессии генов этих клеток. Таким образом, авторами впервые доказан путь работы LCORL как лигандзависимого транскрипционного фактора [3]. Рядом исследований было показано, что LCORL обладает заметным плейотропным эффектом в отношении массы и размеров тела бройлеров [4], коз [5], крупного рогатого скота [6], овец [7]. К тому же выявлена значительная связь относительных уровней экспрессии LCORL с размерами тела лошадей и генотипами замены BIEC2-808543 внутри породы и при межпородном сравнении [1]. В исследованиях A.A. Kudinovа с соавторами [8] была установлена ассоциация SNP rs15619223 гена LCORL с живой массой и весом яйца у кур русской белой породы.

У кур породы белый леггорн яичного направления продуктивности выявлены достоверные ассоциации гена LCORL со среднесуточными приростами живой массы с 8 по 14 неделю [9], а у кур русской белой породы – с живой массой взрослой птицы и массой яйца [10].

Реперные точки в постнатальном периоде жизни – это ключевые точки, которые определяют физическое и физиологическое развитие птиц на различных стадиях их жизни. Выделяется три периода: стартовый (5–6 недель), ювенальной линьки (8–10 недель) и полового созревания (15-16 недель). При выращивании кур-несушек немаловажно уделять внимание их правильному развитию, так как в стартовый период жизни происходит интенсивный рост, который напрямую связан с их дальнейшей яичной продуктивностью [11]. В период ювенильной линьки и начала полового созревания наблюдается значимое усложнение морфологической и функциональной организации всех органов и систем птиц [12]. Наши предыдущие исследования показали, что среднесуточные приросты у курочек и петушков царскосельской породы комбинированного направления продуктивности увеличивались вплоть до 10-недельного возраста, а к 12 неделям снижались практически в два раза, что, по-видимому, связано с гормональной перестройкой организма и половым созреванием [13].

Русская белая порода кур была создана в СССР и относится к яичному направлению продуктивности. Популяция русской белой породы кур ВНИИГРЖ была создана А.Н. Соколовой во второй половине XX века путём отбора на резистентность к низким температурам выращивания в первые дни жизни цыплят с последующим содержанием взрослой птицы в зимний период при температуре ниже 0°С, но при сохранении яичной продуктивности на достаточно высоком уровне. Показатель яйценоскости за 7 месяцев кладки составляет 157±0,9 шт., масса яйца (46 недель) – 59,5±0,2 г [14].

Таким образом, научный интерес состоит в изучении экспрессии гена LCORL в различных тканях органов кур РБ яичного направления продуктивности в периоды активного роста и развития.

Целью исследования является анализ уровня относительной экспрессии гена LCORL в тканях органов у кур русской белой породы в реперные точки постнатального периода (6, 10 и 16 недель) для выявления корреляционных взаимосвязей с некоторыми весовыми и линейными показателями роста.

Материалы и методы

На протяжении проведения исследования цыплята кур РБ содержались на базе биоресурсной коллекции ВНИИГРЖ «Генетическая коллекцияредких исчезающих породкур» (г. Пушкин, Санкт-Петербург). Птица содержалась в групповых секциях по 10 голов в каждой. Рационы кормления соответствовали зоотехническим требованиям. При достижении птицей возраста 6, 10 и 16 недель отбирали условно здоровых особей в количестве трех голов для дальнейшего убоя. Предубойную голодную выдержку проводили в течение 6–8 ч. Перед убоем производили взвешивание птицы. После убоя проводили анатомическую разделку тушек и индивидуальный сбор фенотипических данных: масса печени (г), масса мышц бедра (г), масса мышц голени (г), длина бедренной кости (см), длина большеберцовой кости (ББК) (см), длина двенадцатиперстной кишки (12ПК) (см). Взвешивание частей тушки проводили на весах МК-А22-3,2 (Китай) с точностью до 0,25 г.

Для получения образцов РНК у каждой особи были отобраны образцы тканей надкостницы, 12ПК и печени, которые немедленно замораживались при -80°C и хранились до использования. Выделение РНК проводили с использованием коммерческого набора «ЛИРА+» для выделения РНК, ДНК и белков (ООО «Биолабмикс», Россия). Ткань почки кур использовали в качестве референсного образца. В качестве эндогенного контроля использовали референсный ген домашнего хозяйства курицы RSP17 (Ribosomal protein S17). Дизайн праймеров для генов LCORL и RSP17 осуществляли при помощи базы данных NCBI с использованием программы BLAST.

Последовательность праймеров (ООО «Синтол», Москва) представлена в таблице 1.

Таблица 1 – Праймеры для генов LCORL и RSP17

Ген	F (прямой праймер)	RV (обратный праймер)	Длина фрагмента п.н.
LCORL	ACCAAGGCTACGAAGAGAGACC	GTGTTGGACTGGCCCTGAAT	190
RSP17	ACACCCGTCTGGGCAACGACT	CCCGCTGGATGCGCTTCATCA	129

Режим амплификация кДНК и детекция сигнала были следующими: 95°C – 5 мин – 1 цикл

95°C –15 сек

60°C – 15 сек 40 циклов

72°C – 30 сек

Расчет изменений экспрессии гена LCORL выполняли методом 2ddCt (delta delta Cycle threshold) [15]. Статистическую обработку данных проводили в GraphPad Prizm 12.0 Статистическую значимость разницы исследуемых параметров между группами оценивали методом критерия Манна-Уитни. Корреляционный анализ и построение матриц выполняли с использованием коэффициента Спирмена.

Результаты и обсуждение

На первом этапе исследования были оценены весовые и линейные показатели роста и развития разновозрастных групп курочек РБ (таблица 2). Результаты показали, что все анализируемые показатели, за исключением показателя «длина 12ПК» значимо изменялись до достижения курочками возраста 16 недель. Согласно стандарту породы минимальная средняя живая масса взрослых кур РБ составляет 1,8 кг [16]. Наши данные показывают, что живая масса курочек в 16-недельном возрасте составила около 70% от предполагаемой массы половозрелых кур, что свидетельствует о хорошем и полноценном развитии птицы, включенной в опыт.

Печень – один из центральных органов, участвующий в метаболических процессах и поддержании гомеостаза организма кур. В связи с ее высоким функционалом даже некоторые кратковременные негативные воздействия могут приводить к нарушению ее структуры, внешнего вида и массы. В каждой возрастной группе при визуальном осмотре печени не было установлено видимых изменений цвета и/или текстуры органа. Абсолютные значения массы печени увеличивались с возрастом птицы, при этом относительная масса печени уменьшалась и составила 2,64, 2,3 и 1,8% соответственно в 6, 10 и 16 недель. В группе 16-ти недельных курочек средние значения массы печени составили 23,33±1,50 г, что в целом согласуется с данными авторов [17], в исследованиях которых масса печени у кур яичного кросса Хайсекс Уайт, Декалб Уайт в возрасте 16 недель варьировалась в пределах 20,5–24,4 г.

Как известно, полноценный рост и развитие цыплят во многом определяется состоянием пищеварительной системы и, в частности, длиной 12ПК, где происходит основные процессы всасывания питательных веществ, поступающих с кормом. По данным Г.А. Трифонова [18], основной рост 12ПК у кур происходит на протяжении 21 недели жизни. От вылупления до достижения возраста 150 дней у цыплят кросса «Ломанн Браун» длина 12ПК увеличивалась в 2,9 раза, при этом интенсивный рост наблюдался в период 14–90 суток жизни. По нашим данным, в период от 42 дней (6 нед.) до 112 дней (16 нед.), у кур РБ длина 12ПК увеличилась в 1,2 раза, что в целом не противоречит наблюдениям других авторов.

Таблица 2 – Фенотипические показатели курочек РБ разного возраста

Показатель	Возраст курочек, недель 6           10           16 M±m			p-value
Живая масса, г	383,33±6,94	744,00±73,76	1290,33±22,70	0,021
Масса печени, г	10,14±0,30	17,17±0,67	23,33±1,50	0,021
Масса мышц бедра, г	11,10±0,36	25,87±3,75	51,17±2,62	0,021
Масса мышц голени, г	10,33±0,64	22,80±3,60	40,33±2,13	0,021
Длина бедренной кости, см	4,82±0,07	6,93±0,22	8,30±0,23	0,021
Длина большеберцовой кости, см	6,97±0,33	9,77±0,35	11,50±0,29	0,021
Длина двенадцатиперстной кишки, см	16,93±1,34	18,00±2,25	20,33±1,07	0,312
Примечание: M – среднее значение, m – ошибка среднего значения.

На следующем этапе нашего исследования мы провели сравнительный анализ уровня относительной экспрессии гена LCORL в тканях печени, надкостницы и 12ПК у курочек разных возрастов. Результаты показали, что ген LCORL экспрессируется в период активного роста кур РБ в исследуемых тканях организма. Обращает на себя внимание, что на шестой неделе уровень экспрессии гена LCORL в надкостнице и 12ПК был выше, чем уровень экспрессии в печени. В ткани печени и надкостницы экспрессия понижалась от 6 недели к 16 неделе постепенно, в то время как в 12ПК экспрессия от 6 недели понижалась к 10-й и резко возрастала к 16 неделе (при p < 0,05) (рисунок 1) .

■ надкостница

Рисунок 1 – Относительный уровень экспрессии гена LCORL в исследуемых тканях курочек РБ разных возрастов (при p < 0,05)

12ПК

печень

Сравнительный анализ уровня экспрессии гена LCORL в каждой из анализируемых тканей показал, что в печени экспрессия LCORL была достоверно ниже в 16 недель, чем в 6 и 10 недель (рисунок 2). Схожая картина экспрессионных изменений наблюдалась и в тканях надкостницы, но достоверно высокие значения были получены только для шестой недели относительно 10 и 16 недель. Для тканей 12ПК высокий уровень экспрессии LCORL был получен для 16 недели в сравнении с 6 и 10 неделями.

Рисунок 2 – Сравнительный анализ экспрессии гена LCORL в тканях печени, надкостницы и 12ПК у курочек РБ в разных возрастов, *при p < 0,05

Анализ корреляционных взаимосвязей показал, что уровень экспрессии гена LCORL в 12ПК имел отрицательную связь с уровнем экспрессии в печени и надкостнице. При этом экспрессионные изменения данного гена имели однонаправленную связь в тканях печени и надкостницы (р < 0,05) (рисунок 3). Полученные нами данные показывают, что по мере роста птицы уровень экспрессии гена LCORL снижался в тканях печени и надкостницы, что в целом объясняет наблюдаемые разнонаправленные корреляционные связи между данными показателями (р < 0,05).

dd Ct, LCORL n dd Ct, LCORL h/k dd Ct, LCORL 12ПК живая масса масса печени масса мышц бедра масса мышц голени длина бедреной кости длина ББК длина12ПК

О

Е

О р<0,05

ч га О О га Е ч ф Ю га

Е га о о га

Е

Рисунок 3 – Корреляционные связи уровня относительной экспрессии гена LCORL в исследуемых тканях с некоторыми весовыми и линейными показателями роста и развития курочек РБ

Уровень экспрессии гена LCORL в 12ПК достоверно положительно коррелировал только с показателем длины ББК (р < 0,05).

Анализ литературных источников показал, что тканеспецифическая экспрессионная активность гена LCORL с учетом возрастных характеристик кур яичного направления продуктивности ранее не изучалась. Однако поученные нами данные согласуются с результатами исследований по млекопитающим и другим видам птиц. Так, методом ОТ-ПЦР было установлено, что LCORL высоко экспрессировался во всех одиннадцати тканях овец: сердце, печени, селезенке, легких, почках, рубце, двенадцатиперстной кишке, мышцах, жире, гипоталамусе и гипофизе. Высокие уровни мРНК (p < 0,05) были выявлены преимущественно в селезенке, двенадцатиперстной кишке и легких, так как в данных органах приоритетны процессы, вовлеченные в формирование иммунитета и усвояемость питательных веществ, обеспечивающие рост организма [19]. У крупного рогатого скота уровень экспрессии гена NCAPG в тканях мышц, сердца, печени почки и селезенки в эмбриональный период был достоверно выше, чем у взрослых особей [20]. Высокая транскриптационная активность гена NCAPG-LCORL была выявлена у гусей в мышечной ткани ног и груди в возрасте 10 недель - периода достижения половой зрелости [21].

Результаты настоящего исследования предоставляют новую информацию об особенностях экспрессии гена LCORL у курочек русской белой породы с учетом тканеспецифичности и стадии развития.

Выводы

Впервые было выявлено, что ген LCORL экспрессируется в период активного роста (6 и 10 недель) кур русской белой породы в таких тканях, как печень, надкостница и 12ПК. Уровень экспрессии в надкостнице и 12ПК был выше, чем уровень экспрессии в печени (p < 0,05). В тканях печени и надкостницы экспрессия понижалась от 6 к 16 неделе постепенно, в то время как в 12ПК экспрессия от 6 недели понижалась к 10 и резко возрастала к 16 неделе (p < 0,05). Уровень экспрессии гена LCORL в 12ПК достоверно положительно коррелировал только с показателем длины ББК (р < 0,05), а уровень экспрессии LCORL в тканях печени и надкостницы имел отрицательную достоверную корреляцию с фенотипическими характеристиками кур, а именно – живая масса, масса печени, масса мышц бедра, масса голени, длина бедра, длина ББК. Таким образом, ген LCORL является критическим транскрипционным фактором, влияющим на процессы роста в организме у птиц.

Исследование выполнено при поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации, тема ГЗ 1240202001147.